با وارد کردن کد TAQ15 در هنگام پرداخت، ۱۵٪ تخفیف برای برخی از محصولات Taq دریافت کنید.

مقدمه‌ای بر PCR
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) تکنیکی نسبتاً ساده است که الگوی DNA را تقویت می‌کند تا قطعات DNA خاصی را به صورت in vitro تولید کند. روش‌های سنتی کلونینگ یک توالی DNA در یک وکتور و تکثیر آن در یک سلول زنده معمولاً چند روز یا هفته کار می‌طلبند، اما تقویت توالی‌های DNA با PCR تنها چند ساعت زمان می‌برد. در حالی که اکثر تجزیه و تحلیل‌های بیوشیمیایی، از جمله تشخیص اسیدهای نوکلئیک با رادیواستئیک‌ها، به مقدار قابل توجهی ماده بیولوژیکی نیاز دارند، فرآیند PCR به مقدار بسیار کمی نیاز دارد. بنابراین، PCR می‌تواند تشخیص حساس‌تری داشته باشد و سطوح بالاتری از تقویت توالی‌های خاص را در زمان کمتری نسبت به روش‌های قبلی فراهم کند. این ویژگی‌ها باعث می‌شود این تکنیک نه تنها در تحقیقات پایه، بلکه در کاربردهای تجاری مانند تست هویت ژنتیکی، پزشکی قانونی، کنترل کیفیت صنعتی و تشخیص‌های in vitro بسیار مفید باشد. PCR پایه در بسیاری از آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی مولکولی رایج است؛ جایی که برای تقویت قطعات DNA و شناسایی توالی‌های DNA یا RNA در یک سلول یا محیط استفاده می‌شود. با این حال، PCR فراتر از تقویت و تشخیص ساده پیش رفته و بسیاری از گسترش‌های روش اصلی PCR توصیف شده‌اند. این فصل مرور کلی بر انواع مختلف روش‌های PCR، کاربردها و بهینه‌سازی‌ها ارائه می‌دهد.

PCR پایه
فرآیند PCR در ابتدا برای تقویت بخش‌های کوتاه از یک مولکول DNA بلندتر توسعه یافت (Saiki et al. 1985). یک واکنش تقویت معمولی شامل DNA هدف، یک پلیمراز DNA مقاوم به حرارت، دو پرایمر الیگونوکلئوتیدی، دی‌نوکلئوتیدهای سه‌فسفاتی (dNTPها)، بافر واکنش و منیزیم است. پس از ترکیب، واکنش در یک سیکلر حرارتی قرار می‌گیرد؛ دستگاهی که واکنش را به مجموعه‌ای از دماهای مختلف برای مدت زمان معین می‌سپارد. این مجموعه از تنظیمات دما و زمان به عنوان یک چرخه تقویت شناخته می‌شود. هر چرخه PCR به‌صورت نظری مقدار توالی هدف (آمپلیکون) را در واکنش دو برابر می‌کند. ده چرخه به‌نظری مقدار آمپلیکون را تقریباً هزار برابر می‌کند؛ ۲۰ چرخه، بیش از یک میلیون برابر در عرض چند ساعت.

هر چرخه PCR شامل مراحل جداسازی قالب، چسباندن پرایمر و گسترش پرایمر است. گام اولیه قالب DNA هدف را با گرم کردن به ۹۴ °C یا بالاتر به مدت ۱۵ ثانیه تا ۲ دقیقه جداسازی می‌کند. در این فرآیند، دو رشتهٔ درهم‌تنیدهٔ DNA از یکدیگر جدا می‌شوند و قالب تک‌رشته‌ای لازم برای تکثیر توسط پلیمراز DNA مقاوم به حرارت فراهم می‌شود. در گام بعدی، دما به حدود ۴۰–۶۰ °C کاهش می‌یابد. در این دما، پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی می‌توانند به‌صورت پایدار با DNA هدف جداسازی‌شده ترکیب شوند (چسباندن) و به‌عنوان پرایمر برای پلیمراز DNA عمل کنند. این گام حدود ۱۵–۶۰ ثانیه طول می‌کشد. در نهایت، سنتز DNA جدید آغاز می‌شود؛ دمای واکنش به دمای بهینه برای پلیمراز DNA افزایش می‌یابد. برای اکثر پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت، این دما در محدودهٔ ۷۰–۷۴ °C است. گام گسترش حدود ۱–۲ دقیقه طول می‌کشد. چرخهٔ بعدی با بازگشت به ۹۴ °C برای جداسازی آغاز می‌شود.

هر گام چرخه باید برای هر ترکیب قالب و پرایمر بهینه شود. اگر دماهای گام‌های چسباندن و گسترش مشابه باشند، می‌توان این دو گام را در یک گام ترکیب کرد که هم چسباندن و هم گسترش پرایمر در آن انجام می‌شود. پس از ۲۰–۴۰ چرخه، محصول تقویت‌شده می‌تواند برای اندازه، مقدار، توالی و غیره تجزیه و تحلیل شود یا در مراحل آزمایشی بعدی استفاده گردد.

RT‑PCR
پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت مورد استفاده در PCR پایه به یک قالب DNA نیاز دارند؛ بنابراین این تکنیک محدود به تجزیه و تحلیل نمونه‌های DNA است. اما موارد متعددی وجود دارد که تقویت RNA ترجیح داده می‌شود. برای اعمال PCR بر روی RNA، ابتدا باید نمونهٔ RNA به cDNA تبدیل شود تا قالب DNA لازم برای پلیمراز مقاوم به حرارت فراهم گردد (شکل 1). این فرآیند به‌نام رونویسی معکوس (RT) شناخته می‌شود؛ از این رو نام RT‑PCR به کار می‌رود.

رونویسی معکوس (RT) آنزیم‌های DNA‑پلیمراز RNA‑راهنما هستند که اولین بار به‌عنوان بخشی از چرخهٔ زندگی ریتروویروس شناسایی شدند (Temin و Mizutani 1970؛ Baltimore 1970). RTها سنتز یک نسخهٔ DNA (cDNA) از مولکول‌های RNA هدف را با استفاده از یک پرایمر رونویسی معکوس، dNTPها و Mg2+ یا Mn2+ به‌عنوان کو‑فاکتور کاتالیز می‌کنند. رونویسی معکوس برای کاربردهای مختلف in vitro از جمله RT‑PCR زمان واقعی و انتهایی، تولید پروب‌های cDNA برچسب‌دار و ساخت کتابخانهٔ cDNA سازگار شده است. یک رونویسی معکوس ایده‌آل باید مقاوم (فعالیت بالا تحت شرایط مختلف) باشد و تمام RNAهای پرایمرشدهٔ نمونه را به cDNA تبدیل کند، صرف‌نظر از فراوانی، طول یا ساختار ثانویهٔ آن‌ها.

RTهای شناخته‌شده‌ترین مورد استفاده در زیست‌شناسی مولکولی، RTهای ریتروویروسی هستند: ویروس میلو بلاستوزیس پرندگان (AMV) و ویروس لوسمی موش مولونی (M‑MLV). مهندسی ژنتیک و توسعه بافرهای تقویت‌کنندهٔ RT منجر به در دسترس بودن تجاری آنزیم‌های جدیدی شده است که عملکرد بهتری نسبت به این RTهای طبیعی دارند.

رونویسی معکوس AMV و M‑MLV معمولاً برای تولید یک نسخهٔ DNA از قالب RNA با استفاده از پرایمرهای تصادفی، پرایمر oligo(dT) یا پرایمرهای توالی‑خاص استفاده می‌شوند. برخی پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت (مانند پلیمراز DNA Tth) فعالیت رونویسی معکوس دارند که می‌توان با استفاده از منگنز به‌جای منیزیم به‌عنوان کو‑فاکتور فعال کرد (Myers و Gelfand 1991). پس از این گام اولیهٔ رونویسی معکوس برای تولید قالب cDNA، PCR پایه برای تقویت توالی هدف انجام می‌شود.

کیفیت و خلوص قالب RNA برای موفقیت RT‑PCR حیاتی است. می‌توان از RNA کل یا RNA پلی(A)+ به‌عنوان قالب شروع استفاده کرد، اما هر دو باید سالم و عاری از DNA ژنومی آلوده باشند. استخراج خاص پلی(A)+ RNA پیام‌رسان هدف را غنی می‌کند تا نیاز به واکنش رونویسی معکوس کمتری برای تقویت بعدی داشته باشد. کارایی واکنش سنتز رشتهٔ اول، که به کیفیت RNA مرتبط است، نیز به‌طور قابل‌توجهی بر نتایج تقویت تأثیر می‌گذارد.

GoScript™ Reverse Transcriptase فرمولاسیونی از M‑MLV reverse transcriptase و بافرهای بهینه است که برای سنتز مؤثر و قابل‌تکرار cDNA از طیف گسترده‌ای از رونوشت‌های نادر و فراوان، حتی با قالب‌های دشوار و در حضور مهارکننده‌های PCR، طراحی شده است. GoScript برای استفاده در qPCR تأیید شده و با سیستم‌های GoTaq® RT‑qPCR سازگار است. GoScript به‌صورت مخلوط‌های آماده با پرایمرهای oligo(dT) یا پرایمرهای تصادفی، به‌عنوان کیت کامل یا به‌صورت آنزیم مستقل در دسترس است.

شکل 1. نمودار فرآیند RT‑PCR.

محصولات و منابع RT‑PCR
GoScript® Reverse Transcriptase به‌صورت رونویسی معکوس مستقل یا به‌صورت کیت‌های یک‑مرحله‌ای و دو‑مرحله‌ای RT‑PCR موجود است.
مشاهده محصول مشاهده تمام محصولات RT‑PCR

Hot‑Start PCR
Hot‑Start PCR تکنیکی رایج برای کاهش تقویت غیر‌خاص به‌دلیل ترکیب واکنش‌های تقویت در دمای اتاق است. در دمای اتاق، پرایمرهای PCR می‌توانند به توالی‌های قالبی که کاملاً مکمل نیستند چسبیده شوند. از آنجا که پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت در این دماهای پایین فعالیت دارند (اگرچه در اکثر موارد کمتر از ۲۵٪)، پلیمراز می‌تواند پرایمرهای نادرست را گسترش دهد. این ناحیهٔ تازه‌سنتز شده سپس به‌عنوان قالب برای گسترش پرایمر و سنتز محصولات تقویت ناخواسته عمل می‌کند. اما اگر واکنش قبل از شروع پلیمرازاسیون به دماهای بالای ۶۰ °C گرم شود، سختی چسباندن پرایمر افزایش می‌یابد و سنتز محصولات PCR ناخواسته کاهش یا از بین می‌رود.

Hot‑Start PCR همچنین می‌تواند مقدار پرایمر‑دیمری تولیدشده را با افزایش سختی چسباندن پرایمر کاهش دهد. در دماهای پایین، پرایمرهای PCR می‌توانند به‌یکدیگر از طریق نواحی مکمل چسبیده شوند و پلیمراز DNA می‌تواند پرایمرهای چسبانده‌شده را گسترش دهد تا پرایمر‑دیمری تولید شود که معمولاً به‌صورت باندی پخش‌شدهٔ حدود ۵۰–۱۰۰ bp در ژل رنگ‌آمیزی‌شده با اتیوم‌بروم ظاهر می‌شود. تشکیل محصولات غیر‌خاص و پرایمر‑دیمری می‌تواند با ترکیب واکنش‌های مورد نیاز برای تقویت محصول مطلوب رقابت کند. بنابراین، Hot‑Start PCR می‌تواند بازده محصولات PCR خاص را بهبود بخشد.

برای انجام Hot‑Start PCR دستی، واکنش‌ها روی یخ یا در دمای اتاق ترکیب می‌شوند، اما یک مؤلفهٔ حیاتی تا زمانی که واکنش به ۶۰–۶۵ °C گرم شود، حذف می‌شود؛ سپس مؤلفهٔ گمشده افزوده می‌شود. این حذف از گسترش پرایمرها توسط پلیمراز تا زمان افزودن مؤلفهٔ حیاتی در دمای بالاتر که چسباندن پرایمر سخت‌تر است، جلوگیری می‌کند. با این حال، این روش زمان‌بر است و خطر آلودگی را افزایش می‌دهد. رویکرد دوم، کمتر کاربرپسند، شامل غیرفعال‌سازی معکوس یا جداسازی فیزیکی یک یا چند مؤلفهٔ حیاتی در واکنش است. به‌عنوان مثال، منیزیم یا پلیمراز DNA می‌تواند در یک دانهٔ مومی که در دمای ۹۴ °C (در مرحلهٔ جداسازی) ذوب می‌شود، محصور شود؛ این کار مؤلفه را فقط در دماهای بالاتر آزاد می‌کند (Carothers et al. 1989؛ Krishnan et al. 1991؛ Clark 1988). پلیمراز DNA همچنین می‌تواند در حالت غیرفعال توسط اتصال به یک الیگونوکلئوتید (aptamer) (Lin و Jayasena 1997؛ Dang و Jayasena 1996) یا یک آنتی‌بادی (Scalice et al. 1994؛ Sharkey et al. 1994) نگه داشته شود. این پیوند در دماهای بالاتر شکسته می‌شود و پلیمراز فعال می‌شود. در نهایت، پلیمراز DNA می‌تواند از طریق تغییر شیمیایی غیرفعال بماند (Moretti et al. 1998).

محصولات و منابع Hot‑Start PCR
GoTaq® G2 Hot Start Taq به‌صورت آنزیم مستقل یا مخلوط مستر موجود است؛ در این فرمولاسیون، پلیمراز Taq به یک آنتی‌بادی اختصاصی متصل است که فعالیت آن را مسدود می‌کند. فعالیت در طول جداسازی اولیه بازگردانده می‌شود و امکان Hot‑Start PCR فراهم می‌شود.
مشاهده پلیمراز Hot‑Start مشاهده مخلوط‌های مستر

Long‑Range PCR
تقویت قطعات DNA طولانی برای کاربردهای متعددی مانند نقشه‌برداری فیزیکی (Rose 1991) و کلونینگ مستقیم از ژنوم‌ها مطلوب است. در حالی که PCR پایه برای تقویت قطعات کوچک کارآمد است، کارایی تقویت (و در نتیجه بازده قطعات تقویت‌شده) به‌طور قابل‌توجهی با افزایش طول آمپلیکون بیش از ۵ kb کاهش می‌یابد. این کاهش بازده به دلیل تجمع محصولات کوتاه‌شده است که برای دوره‌های بعدی تقویت مناسب نیستند؛ این محصولات به‌صورت باندهای پخش‌شده در ژل ظاهر می‌شوند.

در سال ۱۹۹۴، Wayne Barnes (Barnes 1994) و سایر پژوهشگران (Cheng et al. 1994) عوامل مؤثر بر پلیمرازاسیون در نواحی بزرگتر DNA توسط پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت را بررسی کردند و متغیرهای کلیدی مؤثر بر بازده قطعات PCR طولانی را شناسایی کردند. آنها رویکردی با ترکیب دو پلیمراز مقاوم به حرارت برای سنتز قطعات PCR طولانی‌تر ارائه دادند. اولین پلیمراز فاقد فعالیت ۳′→۵′ اگزونوکلئاز (پروف‌ریدینگ) است؛ دومین آنزیم که در غلظت کمتری حضور دارد، فعالیت پروف‌ریدینگ قدرتمندی دارد. به‌نظر می‌رسد وقتی پلیمراز DNA بدون پروف‌ریدینگ (مثلاً Taq) یک dNTP را به‌صورت نادرست وارد می‌کند، گسترش بعدی یا به‌شدت کند می‌شود یا کاملاً متوقف می‌شود. پلیمراز پروف‌ریدینگ (مثلاً Pfu یا Tli) نوکلئوتید نادرست را حذف می‌کند و اجازه می‌دهد پلیمرازها به گسترش رشتهٔ جدید ادامه دهند.

اگرچه استفاده از دو پلیمراز DNA مقاوم به حرارت می‌تواند بازده را به‌طور قابل‌توجهی افزایش دهد، شرایط دیگر نیز می‌توانند تأثیر مهمی بر بازده قطعات PCR طولانی داشته باشند (Cheng et al. 1995). به‌طور منطقی، زمان‌های گسترش طولانی‌تر می‌تواند بازده قطعات طولانی‌تر را افزایش دهد زیرا محصولات جزئی کمتر ساخته می‌شوند. زمان‌های گسترش به طول هدف بستگی دارد؛ زمان‌های ۱۰–۲۰ دقیقه رایج است. علاوه بر این، کیفیت قالب حیاتی است. دی‌پوریناسیون قالب که در دماهای بالا و pH پایین تشدید می‌شود، منجر به تولید محصولات جزئی بیشتر و کاهش بازده کلی می‌شود. در PCR طولانی، زمان جداسازی به ۲–۱۰ ثانیه کاهش می‌یابد تا دی‌پوریناسیون قالب کاهش یابد. افزودنی‌هایی مانند گلیسرول و دی‌متیل‌سولفوکسید (DMSO) نیز به کاهش دماهای جداسازی رشته و چسباندن پرایمر کمک می‌کنند و برخی اثرات دی‌پوریناسیون ناشی از دماهای بالا را کاهش می‌دهند. Cheng و همکاران همچنین دریافتند که کاهش غلظت پتاسیم به‌مقدار ۱۰–۴۰٪ کارایی تقویت قطعات طولانی‌تر را افزایش می‌دهد (Cheng et al. 1995).

Long PCR Master Mix
GoTaq® Long PCR Master Mix حاوی Taq Hot‑Start در مخلوطی ویژه با یک پلیمراز پروف‌ریدینگ حرارتی ثابت است. این ترکیب بهینه‌شده امکان تقویت مؤثر تا ۴۰ kb از DNA لامبدا یا ۳۰ kb از DNA ژنومی انسانی را فراهم می‌کند.
مشاهده Long PCR Master Mix

qPCR و RT‑qPCR
Quantitative Endpoint PCR
PCR و RT‑PCR معمولاً به‌صورت کیفی برای ارزیابی نمونه‌های زیستی استفاده می‌شوند. با این حال، کاربردهای متنوعی مانند تعیین بار ویروسی، اندازه‌گیری پاسخ به داروهای درمانی و توصیف بیان ژن می‌توانند با تعیین کمی میزان هدف بهبود یابند. نظریه‌ای این است که به‌دلیل طبیعت نمایی PCR، رابطهٔ خطی بین تعداد چرخه‌های تقویت و لگاریتم تعداد مولکول‌ها وجود دارد؛ بنابراین به‌نظر می‌رسد به‌راحتی قابل‌دسترس باشد. در عمل، کارایی تقویت به‌دلیل آلودگی‌ها (مهارکننده‌ها)، واکنش‌های رقابتی، خستگی سوبسترا، غیرفعال‌سازی پلیمراز و بازچسباندن هدف کاهش می‌یابد. با افزایش تعداد چرخه‌ها، کارایی تقویت کاهش می‌یابد و در نهایت به اثر پلیتوی می‌رسد.

به‌طور معمول، PCR کمی باید پیش از مرحلهٔ پلیتوی اندازه‌گیری شود تا رابطهٔ بین تعداد چرخه‌ها و مولکول‌ها نسبتاً خطی باشد. این نقطه باید به‌صورت تجربی برای واکنش‌های مختلف تعیین شود؛ زیرا عوامل متعددی می‌توانند کارایی تقویت را تحت تأثیر قرار دهند. چون اندازه‌گیری پیش از پلیتوی انجام می‌شود، PCR کمی از تعداد چرخه‌های کمتری نسبت به PCR پایه استفاده می‌کند؛ این می‌تواند در تشخیص محصول نهایی مشکل ایجاد کند زیرا محصول کمتری برای شناسایی وجود دارد.

برای نظارت بر کارایی تقویت، بسیاری از کاربردها شامل یک استاندارد داخلی در PCR می‌شوند. یک روش شامل یک جفت پرایمر دوم است که برای یک ژن «خانه‌دار» (یعنی ژنی با سطوح بیان ثابت در میان نمونه‌های مقایسه‌شده) در واکنش طراحی می‌شود (Gaudette و Crain 1991؛ Murphy et al. 1990). تقویت ژن‌های خانه‌دار تأیید می‌کند که اسید نوکلئیک هدف و ترکیبات واکنش کیفیت قابل قبولی داشته‌اند، اما تفاوت‌های کارایی تقویت به‌دلیل تفاوت در اندازه محصول یا کارایی چسباندن پرایمر بین استاندارد داخلی و هدف کمی‌سازی‌شده را در نظر نمی‌گیرد.

مفهوم PCR رقابتی—یک نوع از PCR کمی—پاسخی به این محدودیت است. در PCR رقابتی، مقدار معینی از یک قالب کنترل به واکنش افزوده می‌شود. این قالب با همان جفت پرایمر که برای مولکول هدف آزمایشی استفاده می‌شود تقویت می‌شود اما محصولی متمایز (مثلاً اندازه متفاوت، الگوی برش محدود‌کننده و غیره) تولید می‌کند. پس از تقویت، مقادیر کنترل و محصول آزمایشی مقایسه می‌شوند. اگرچه این روش‌ها کیفیت اسید نوکلئیک هدف، ترکیبات بافر و کارایی چسباندن پرایمر را کنترل می‌کنند، محدودیت‌های خود را دارند (Siebert و Larrick 1993؛ McCulloch et al. 1995)، از جمله این‌که بسیاری از آن‌ها به تجزیه نهایی توسط الکتروفورز وابسته‌اند.

آزمون‌های فلورسانس و فاز‑جامد متعددی برای اندازه‌گیری مقدار محصول تقویت‌شده در هر واکنش وجود دارد، اما اغلب نتوانند DNA تقویت‌شدهٔ موردنظر را از محصولات تقویت غیر‌خاص جدا کنند. برخی از این تجزیه‌ها به تکنیک‌های بلاتینگ متکی‌اند که متغیر دیگری به‌دلیل کارایی انتقال اسید نوکلئیک وارد می‌شود، در حالی که سایر آزمون‌ها برای حذف نیاز به الکتروفورز توسعه یافته‌اند اما همچنان خاصیت موردنظر را فراهم می‌کنند. PCR زمان واقعی که امکان مشاهده نتایج هر چرخه تقویت را می‌دهد، روشی محبوب برای غلبه بر نیاز به تجزیه الکتروفورزی است.

Quantitative Real‑Time PCR
استفاده از پروب‌های الیگونوکلئوتیدی یا پرایمرهای برچسب‌دار با فلورسانس یا رنگ‌های بایندینگ DNA فلورسانس برای تشخیص و کمی‌سازی محصول PCR امکان انجام PCR کمی به‌صورت زمان واقعی را می‌دهد. ابزارهای ویژه هم‌زمان سیکلینگ حرارتی برای تقویت هدف و تشخیص فلورسانس برای نظارت بر انباشت محصول PCR را انجام می‌دهند. رنگ‌های بایندینگ DNA استفاده آسانی دارند اما بین محصولات PCR خاص و غیرخاص تمایز قائل نمی‌شوند و برای واکنش‌های چندگانه مناسب نیستند. پروب‌های نوکلئیک اسید برچسب‌دار فلورسانس این مزیت را دارند که فقط با محصولات PCR خاص واکنش می‌دهند، اما ممکن است گران‌قیمت و دشوار برای طراحی باشند. برخی فناوری‌های qPCR به جای پروب، پرایمرهای PCR برچسب‌دار با فلورسانس استفاده می‌کنند.

استفاده از رنگ‌های بایندینگ DNA یکی از ساده‌ترین روش‌های qPCR است. رنگ به سادگی به واکنش افزوده می‌شود و فلورسانس در هر چرخه PCR اندازه‌گیری می‌شود. چون فلورسانس این رنگ‌ها در حضور DNA دو‌رشته‌ای به‌طور چشمگیری افزایش می‌یابد، می‌توان سنتز DNA را به‌عنوان افزایش سیگنال فلورسانس نظارت کرد. با این حال، معمولاً باید پیش از این کار اطمینان حاصل شود که شرایط PCR فقط محصول خاصی تولید می‌کند. در واکنش‌های بعدی، می‌توان تقویت خاص را با تجزیهٔ منحنی ذوب (melt curve) تأیید کرد. منحنی‌های ذوب حرارتی با اجازه دادن به تمام محصول برای تشکیل DNA دو‌رشته‌ای در دمای پایین (حدود ۶۰ °C) و سپس افزایش تدریجی دما تا سطوح جداسازی (حدود ۹۵ °C) تولید می‌شوند. طول و توالی محصول بر دمای ذوب (Tm) تأثیر می‌گذارد؛ بنابراین منحنی ذوب برای توصیف یکنواختی آمپلیکون استفاده می‌شود. تقویت غیر‌خاص می‌تواند با قله‌های پهن در منحنی ذوب یا قله‌های با Tm غیرمنتظره شناسایی شود. با تمایز بین محصولات تقویت خاص و غیرخاص، منحنی ذوب یک جنبهٔ کنترل کیفیت را در استفادهٔ روتین اضافه می‌کند. تولید منحنی ذوب در آزمون‌هایی که به فعالیت ۵′→۳′ اگزونوکلئاز پلیمراز Taq متکی هستند (مانند فناوری TaqMan®) امکان‌پذیر نیست.

برخی استراتژی‌های qPCR از پروب‌های نوکلئیک اسید مکمل برای کمی‌سازی هدف DNA استفاده می‌کنند. این پروب‌ها همچنین می‌توانند برای شناسایی پلی‌مورفیسم‌های تک‌نوکلئوتیدی (SNP) به کار روند (Lee et al. 1993؛ Bernard et al. 1998). دسته‌های کلی پروب‌های PCR زمان واقعی شامل پروب‌های هیدرولیز، پروب‌های هیرپین و پروب‌های سادهٔ هیبریداسیون هستند. این پروب‌ها شامل توالی مکملی هستند که به محصول PCR در حال انباشت چسبیده می‌شود، اما می‌توانند در تعداد و مکان گزارشگرهای فلورسانس متفاوت باشند.

پروب‌های هیدرولیز با یک فلور در انتهای ۵′ و یک کوئنچر در انتهای ۳′ برچسب‌گذاری می‌شوند؛ چون این دو گزارشگر در نزدیکی یکدیگر هستند، سیگنال فلورسانس خاموش می‌شود. در مرحلهٔ چسباندن، پروب به محصول PCR تولیدشده در چرخه‌های قبلی هیبرید می‌شود. هیبرید پروب:هدف به‌عنوان سوبسترا برای فعالیت ۵′→۳′ اگزونوکلئاز DNA پلیمراز عمل می‌کند که پروب چسبانده‌شده را تجزیه می‌کند و فلور را آزاد می‌سازد (Holland et al. 1991). فلور از اثر کوئنچر جذب‌کننده انرژی آزاد می‌شود و پیشرفت واکنش و انباشت محصول PCR با افزایش فلورانس نظارت می‌شود. با این روش، آزمایش‌های مقدماتی باید پیش از آزمایش‌های کمی انجام شوند تا نشان دهند سیگنال تولید‌شده متناسب با مقدار محصول PCR موردنظر است و تقویت غیر‌خاص رخ نمی‌دهد.

پروب‌های هیرپین، که به‌عنوان «مِیقان‌های مولکولی» نیز شناخته می‌شوند، شامل تکرارهای معکوس هستند که توسط توالی مکمل هدف DNA جدا می‌شوند. تکرارها به‌صورت ساختار هیرپین می‌چسبند که در آن فلور در انتهای ۵′ و کوئنچر در انتهای ۳′ در نزدیکی یکدیگر قرار دارند و سیگنال فلورسانس کمی است. پروب هیرپین به‌گونه‌ای طراحی می‌شود که ترجیحاً به هدف DNA متصل شود نه ساختار هیرپین را حفظ کند. با پیشرفت واکنش، تعداد بیشتری از پروب به محصول PCR انباشت‌شده چسبیده و فلور و کوئنچر فیزیکی از هم جدا می‌شوند؛ فلور دیگر خاموش نمی‌شود و سطح فلورانس افزایش می‌یابد. یکی از مزایای این تکنیک این است که پروب‌های هیرپین کمتر احتمال دارد که به‌صورت نادرست ترکیب شوند نسبت به پروب‌های هیدرولیز (Tyagi et al. 1998). با این حال، آزمایش‌های مقدماتی باید نشان دهند سیگنال مخصوص محصول PCR موردنظر است و تقویت غیر‌خاص رخ نمی‌دهد.

استفاده از پروب‌های سادهٔ هیبریداسیون شامل دو پروب برچسب‌دار یا به‌جای آن یک پروب برچسب‌دار و یک پرایمر PCR برچسب‌دار است. در روش اول، انرژی منتشرشده توسط فلور در یک پروب توسط فلور در پروب دوم که نزدیک به آن هیبرید می‌شود جذب می‌شود. در روش دوم، انرژی منتشرشده توسط فلور در پرایمر به‌عنوان یک فلور دوم که در محصول PCR به‌عنوان بخشی از پرایمر وارد می‌شود جذب می‌شود. هر دو روش منجر به افزایش فلورانس پذیرنده انرژی و کاهش فلورانس دهنده انرژی می‌شوند. استفاده از پروب‌های هیبریداسیون می‌تواند حتی ساده‌تر شود به‌طوری که تنها یک پروب برچسب‌دار لازم باشد. در این روش، خاموش‌سازی فلور توسط دئوکسی‌گوانین برای ایجاد تغییر در فلورانس استفاده می‌شود (Crockett و Wittwer 2001؛ Kurata et al. 2001). پروب برچسب‌دار به‌گونه‌ای هیبرید می‌شود که فلور در نزدیکی باقی‌مانده‌های G در توالی هدف باشد و با افزایش چسباندن پروب، فلورانس به‌دلیل خاموش‌سازی توسط دئوکسی‌گوانین کاهش می‌یابد. این روش مکان پروب را محدود می‌کند زیرا پروب باید به‌گونه‌ای هیبرید شود که رنگ فلور نزدیک به یک باقی‌ماندهٔ G باشد. مزیت پروب‌های سادهٔ هیبریداسیون قابلیت ترکیب‌پذیری بیشتر نسبت به پروب‌های هیدرولیز و هیرپین است، زیرا می‌توان از فلورهای رنگی مختلف و پروب‌های با دمای ذوب متفاوت استفاده کرد (مروری در Wittwer et al. 2001).

محصولات و منابع qPCR
کیت‌های GoTaq® qPCR و RT‑qPCR برای روش‌های مبتنی بر رنگ یا پروب در زمان واقعی در دسترس هستند. سیستم‌های GoTaq qPCR شامل رنگ BRYT Green است که حداکثر کارایی تقویت و فلورانس بیشتری نسبت به SYBR Green فراهم می‌کند.

سیستم‌های GoTaq® Probe کیت‌های مستر آماده هستند که ترکیب واکنش را برای تشخیص مبتنی بر پروب هیدرولیز ساده می‌کنند.

ملاحظات کلی برای بهینه‌سازی PCR
این بحث بر استفاده از پلیمراز DNA Taq در PCR متمرکز است، زیرا این آنزیم رایج‌ترین آنزیم مورد استفاده در PCR است. بسیاری از این پیشنهادها هنگام استفاده از پلیمرازهای DNA دیگر نیز کاربرد دارند.

غلظت منیزیم
منیزیم یک کو‑فاکتور ضروری برای پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت است و غلظت منیزیم یک عامل کلیدی است که می‌تواند موفقیت تقویت را تحت تأثیر قرار دهد. غلظت DNA قالب، عوامل شیمی‌دار (مانند EDTA یا سیترات)، غلظت dNTPها و حضور پروتئین‌ها می‌توانند مقدار منیزیم آزاد در واکنش را تغییر دهند. در غیاب منیزیم آزاد کافی، پلیمراز DNA Taq غیرفعال می‌شود. منیزیم آزاد بیش از حد وفاداری آنزیم را کاهش می‌دهد (Eckert و Kunkel 1990) و ممکن است سطح تقویت غیر‌خاص را افزایش دهد (Williams 1989؛ Ellsworth et al. 1993). به همین دلایل، پژوهشگران باید به‌صورت تجربی غلظت بهینهٔ منیزیم را برای هر هدف تعیین کنند. برای این کار، مجموعه‌ای از واکنش‌ها با ۱.۰–۴.۰ mM Mg²⁺ در گام‌های ۰.۵–۱ mM تنظیم کنید و نتایج را مشاهده کنید تا غلظتی که بیشترین بازده محصول و کمترین محصول غیر‌خاص را می‌دهد، شناسایی کنید. اثر غلظت منیزیم و دامنهٔ بهینه می‌تواند بسته به پلیمراز DNA خاص متفاوت باشد. به‌عنوان مثال، عملکرد پلیمراز DNA Pfu به‌نظر می‌رسد کمتر به غلظت منیزیم وابسته باشد، اما وقتی بهینه‌سازی لازم است، غلظت بهینه معمولاً در محدودهٔ ۲–۶ mM است.

بسیاری از پلیمرازهای DNA با بافر واکنش بدون منیزیم و یک لولهٔ ۲۵ mM MgCl₂ عرضه می‌شوند تا بتوانید غلظت Mg²⁺ را برای هر واکنش به‌طور بهینه تنظیم کنید. قبل از ترکیب واکنش‌ها، حتماً محلول منیزیم را کاملاً ذوب کنید و قبل از پپت‌زنی چند ثانیه تکان دهید. محلول‌های MgCl₂ می‌توانند پس از چندین چرخهٔ یخ‌زدایی‑یخ‌زدایی گرادیان غلظت ایجاد کنند؛ تکان‌دادن به‌منظور به‌دست آوردن محلول یکنواخت ضروری است. این دو گام، اگرچه ساده به‌نظر می‌رسند، منبع بسیاری از آزمایش‌های ناموفق را از بین می‌برند.

برخی دانشمندان ترجیح می‌دهند از بافرهای واکنش استفاده کنند که قبلاً MgCl₂ را با غلظت نهایی ۱.۵ mM دارند. باید توجه داشت که Hu et al. (1992) گزارش کردند که بافرهای حاوی منیزیم می‌توانند تغییرات عملکردی داشته باشند. تغییرات آزاد منیزیم به‌مقدار ۰.۶ mM که در آزمایش‌های آن‌ها مشاهده شد، به‌طور چشمگیری بازده تقویت را به‌صورت آلل خاص تحت تأثیر قرار داد. نویسندگان دریافتند که گرم کردن بافر در ۹۰ °C به‌مدت ۱۰ دقیقه همگنی محلول را بازمی‌گرداند. آن‌ها فرض کردند که MgCl₂ به‌دلیل چندین چرخهٔ یخ‌زدایی‑یخ‌زدایی رسوب می‌کند.

شکل 2. اثرات غلظت منیزیم بر تقویت. تقویت‌ها با غلظت‌های مختلف Mg برای نشان دادن اثر بر تقویت یک ژن هدف ۱.۸ kb لوسیداز انجام شد. محصولات واکنش با الکتروفورز آگاروز و رنگ‌آمیزی اتیوم‌بروم تجزیه و تحلیل شدند. خط M، نشانگرهای DNA Promega pGEM® (Cat.# G1741)؛ خط ۱، ۰ mM Mg²⁺؛ خط ۲، ۰.۵ mM Mg²⁺؛ خط ۳، ۱ mM Mg²⁺؛ خط ۴، ۱.۵ mM Mg²⁺؛ خط ۵، ۲ mM Mg²⁺؛ خط ۶، ۲.۵ mM Mg²⁺؛ خط ۷، ۳ mM Mg²⁺؛ خط ۸، ۳.۵ mM Mg²⁺.

ملاحظات بافر
اکثر بافرهای واکنش شامل یک عامل بافر، اغلب بافر مبتنی بر Tris، و نمک، معمولاً KCl هستند. بافر pH واکنش را تنظیم می‌کند که بر فعالیت و وفاداری پلیمراز DNA تأثیر دارد. غلظت‌های متوسط KCl فعالیت پلیمراز DNA را ۵۰–۶۰ % نسبت به عدم حضور KCl افزایش می‌دهد؛ ۵۰ mM KCl به‌عنوان غلظت بهینه در نظر گرفته می‌شود (Gelfand 1989).

GoTaq® DNA Polymerase حاوی پلیمراز DNA Taq بومی در یک فرمولاسیون اختصاصی است. این آنزیم با 5X Green GoTaq® Reaction Buffer و 5X Colorless GoTaq® Reaction Buffer عرضه می‌شود. 5X Green GoTaq® Reaction Buffer شامل رنگ‌های آبی و زرد است که در الکتروفورز جدا می‌شوند تا پیشرفت مهاجرت را نظارت کنند. این بافر همچنین حاوی ترکیبی است که چگالی نمونه را افزایش می‌دهد تا در چاهک آگاروز غوطه‌ور شود و واکنش‌ها بتوانند مستقیماً در ژل لود شوند بدون نیاز به رنگ لودینگ. رنگ آبی با سرعت همانند یک باند DNA ۳–۵ kb در ژل ۱ % آگاروز مهاجرت می‌کند. رنگ زرد با سرعتی سریع‌تر از پرایمرها (<۵۰ bp) در ژل ۱ % آگاروز حرکت می‌کند. 5X Colorless GoTaq® Reaction Buffer و 5X Green GoTaq® Reaction Buffer همان ترکیب را دارند به‌جز رنگ‌ها. 5X Colorless GoTaq® Reaction Buffer برای هر کاربردی که اندازه‌گیری جذب یا فلورسانس آمپلیکون PCR بدون پاک‌سازی قبلی انجام می‌شود، توصیه می‌شود. هر دو بافر با pH 8.5 عرضه می‌شوند و MgCl₂ را با غلظت ۷.۵ mM دارند که منجر به غلظت نهایی ۱.۵ mM می‌شود.

GoTaq® Flexi DNA Polymerase با 5X Green GoTaq® Flexi Reaction Buffer و 5X Colorless GoTaq® Flexi Reaction Buffer عرضه می‌شود. ترکیب‌ها مشابه 5X Green GoTaq® Reaction Buffer و 5X Colorless GoTaq® Reaction Buffer هستند، به‌جز این‌که بافرهای Flexi منیزیم ندارند. به‌جای آن، GoTaq® Flexi DNA Polymerase با یک لولهٔ ۲۵ mM MgCl₂ عرضه می‌شود تا واکنش‌ها بتوانند با غلظت‌های مختلف منیزیم تکمیل شوند.

غلظت آنزیم
ما توصیه می‌کنیم در یک واکنش تقویت ۵۰ µl، ۱–۱.۲۵ واحد پلیمراز DNA Taq استفاده کنید. در اکثر موارد این مقدار بیش از حد کافی است و افزودن بیشتر آنزیم بازده محصول را به‌طور قابل‌توجهی افزایش نمی‌دهد. در واقع، مقادیر بالاتر آنزیم احتمال بروز مصنوعات مرتبط با فعالیت اگزونوکلئاز ۵′→۳′ ذاتی پلیمراز DNA Taq را افزایش می‌دهد که منجر به باندهای پخش‌شده در ژل آگاروز می‌شود (Longley et al. 1990؛ Bell و DeMarini 1991).

خطاهای پپت‌زنی یکی از دلایل شایع سطوح بیش از حد آنزیم هستند. دوز دقیق حجم‌های کوچک محلول‌های آنزیم در ۵۰ % گلیسرول دشوار است؛ بنابراین ما قویاً توصیه می‌کنیم یک مخلوط مستر واکنش تهیه کنید که حجم هر واکنش بزرگ‌تر باشد تا خطاهای پپت‌زنی کاهش یابد.

طراحی پرایمر PCR
پرایمرهای PCR ناحیه هدف را تعریف می‌کنند و معمولاً طول آن‌ها بین ۱۵–۳۰ بازده است. ایده‌آل است که پرایمرها دارای محتوای GC بین ۴۰–۶۰ % باشند. از سه نوکلئوتید G یا C متوالی در نزدیکی انتهای ۳′ پرایمر خودداری کنید تا چسباندن غیر‌خاص پرایمر کاهش یابد. همچنین از پرایمرهایی که توالی‌های تک‌مکمل داخل یا بین مولکولی دارند خودداری کنید تا تولید پرایمر‑دیمری کاهش یابد. نواحی داخلی ساختار ثانویه می‌توانند با چسباندن پرایمر به قالب تداخل داشته باشند و باید اجتناب شوند.

به‌طور ایده‌آل، دمای ذوب (Tm) دو پرایمر—دمای‌ای که ۵۰ % از مولکول‌های پرایمر به توالی مکمل چسبیده‌اند—باید در محدودهٔ ۵ °C باشد تا پرایمرها به‌صورت مؤثر در همان دما چسبیده شوند. پرایمرها می‌توانند شامل توالی‌هایی باشند که برای کاربردهای بعدی مفید هستند؛ به‌عنوان مثال، سایت‌های محدود‌کننده می‌توانند در انتهای ۵′ پرایمرها قرار گیرند تا کلونینگ محصول PCR آسان شود، یا پروموتر T7 RNA پلی‌مراز می‌تواند افزوده شود تا امکان رونویسی in vitro بدون نیاز به زیرکلونینگ در یک وکتور فراهم شود.

کیفیت قالب
تقویت موفق به مقدار و کیفیت قالب DNA وابسته است. مواد شیمیایی معمولاً برای خالص‌سازی اسیدهای نوکلئیک (نمک‌ها، گوانیدین، پروتئازها، حلال‌های آلی و SDS) استفاده می‌شوند که مهارکننده‌های قدرتمند پلیمرازهای DNA هستند. به‌عنوان مثال، ۰.۰۱ % SDS فعالیت پلیمراز DNA Taq را ۹۰ % مهار می‌کند، در حالی که ۰.۱ % SDS آن را ۹۹.۹ % مهار می‌کند (Konat et al. 1994). سایر مهارکننده‌های PCR شامل فنول (Katcher و Schwartz 1994)، هپارین (Beutler et al. 1990؛ Holodniy et al. 1991)، زایلن سیانول، بروموفنول آبی (Hoppe et al. 1992)، پلی‌ساکاریدهای گیاهی (Demeke و Adams 1992) و پلی‌آمین‌های اسپرمین و اسپرمیدین (Ahokas و Erkkila 1993) هستند. در برخی موارد، مهارکننده بدون اینکه با قالب اسید نوکلئیک وارد واکنش شود، می‌تواند آزاد شود؛ مثال خوب این است که ماده‌ای مهارکننده می‌تواند از پلی‌استایرن یا پلی‌پروپیلن هنگام تابش نور فرابنفش آزاد شود (Pao et al. 1993؛ Linquist et al. 1998).

اگر واکنش تقویت شکست خورد و مشکوک به آلودگی قالب DNA با مهارکننده هستید، قالب DNA مشکوک را به یک واکنش کنترل با قالب DNA و جفت پرایمر که قبلاً به‌خوبی تقویت شده‌اند، اضافه کنید. عدم تقویت DNA کنترل معمولاً نشان‌دهنده حضور مهارکننده است. ممکن است نیاز به گام‌های اضافی برای پاک‌سازی قالب DNA باشد، مانند استخراج فنول:کلروفرم یا رسوب‌گذاری الکل.

مقدار قالب
مقدار قالب مورد نیاز برای تقویت موفق به پیچیدگی نمونه DNA بستگی دارد. به‌عنوان مثال، در یک پلاسمید ۴ kb که شامل توالی هدف ۱ kb است، ۲۵ % DNA ورودی توالی هدف است. در مقابل، توالی هدف ۱ kb در ژنوم انسانی (۳.۳ × ۱۰⁹ bp) تقریباً ۰.۰۰۰۰۳ % DNA ورودی را تشکیل می‌دهد. بنابراین، برای حفظ تعداد یکسانی از نسخه‌های هدف در هر واکنش، تقریباً یک میلیون برابر DNA ژنومی انسانی لازم است. خطاهای رایج شامل استفاده از مقدار زیاد DNA پلاسمید، مقدار زیاد محصول PCR یا مقدار کم DNA ژنومی به‌عنوان قالب است. واکنش‌های با مقدار کم قالب DNA بازده کمی دارند، در حالی که واکنش‌های با مقدار زیاد قالب DNA می‌توانند با تقویت غیر‌خاص مواجه شوند. اگر امکان‌پذیر باشد، با بیش از ۱۰⁴ نسخه از توالی هدف شروع کنید تا سیگنال در ۲۵–۳۰ چرخه به‌دست آید، اما سعی کنید غلظت نهایی DNA در واکنش ≤۱۰ ng/µl باشد. هنگام تقویت مجدد یک محصول PCR، غلظت محصول خاص PCR اغلب ناشناخته است؛ ما توصیه می‌کنیم واکنش تقویت قبلی را ۱:۱۰ تا ۱:۱۰,۰۰۰ رقیق کنید قبل از تقویت مجدد.

۱ µg RNA ۱ kb = ۱.۷۷ × ۱۰¹² مولکول
۱ µg dsDNA ۱ kb = ۹.۱۲ × ۱۰¹۱ مولکول
۱ µg DNA وکتور pGEM® = ۲.۸۵ × ۱۰¹۱ مولکول
۱ µg DNA لامبدا = ۱.۹ × ۱۰¹⁰ مولکول
۱ µg DNA ژنومی E. coli = ۲ × ۱۰⁸ مولکول
۱ µg DNA ژنومی انسانی = ۳.۰۴ × ۱۰⁵ مولکول

پارامترهای سیکل
دو پارامتر سیکل که معمولاً تنظیم می‌شوند، دمای چسباندن و زمان گسترش هستند. طول و دماهای سایر گام‌های چرخه PCR معمولاً تغییرات قابل‌توجهی ندارند. با این حال، در برخی موارد می‌توان زمان جداسازی را کوتاه کرد یا دمای جداسازی پایین‌تری استفاده کرد تا تعداد رویدادهای دی‌پوریناسیون—که می‌تواند به جهش‌های محصول PCR منجر شود—کاهش یابد.

دماهای چسباندن عمدتاً توسط توالی پرایمر تعیین می‌شود و معمولاً در حدود ۵ °C از دمای ذوب پرایمرها است. استفاده از دمای چسباندن کمی بالاتر از Tm پرایمرها سختی چسباندن را افزایش می‌دهد و می‌تواند چسباندن غیر‌خاص پرایمرها را به حداقل برساند و مقدار محصولات ناخواسته را کاهش دهد. استفاده از دمای چسباندن کمی پایین‌تر از Tm می‌تواند بازده بالاتری بدهد، زیرا پرایمرها در دمای پایین‌تر کارآمدتر چسبیده می‌شوند. ما توصیه می‌کنیم چند دمای چسباندن مختلف را آزمایش کنید؛ شروع حدود ۵ °C زیر Tm برای تعیین بهترین شرایط چسباندن. در بسیاری از موارد، تقویت غیر‌خاص و تشکیل پرایمر‑دیمری می‌تواند با بهینه‌سازی دمای چسباندن کاهش یابد؛ اگر محصولات PCR ناخواسته همچنان مشکل‌ساز باشند، می‌توانید یکی از روش‌های Hot‑Start PCR را به کار ببرید.

سازندگان پرایمر معمولاً تخمینی از Tm پرایمر را ارائه می‌دهند. Tm همچنین می‌تواند با استفاده از محاسبه‌گرهای بیومث (Biomath Calculators) محاسبه شود. فرمول‌های متعددی برای تعیین Tm نظری اسیدهای نوکلئیک وجود دارد (Baldino Jr. et al. 1989؛ Rychlik et al. 1990). فرمول زیر می‌تواند برای تخمین دمای ذوب الیگونوکلئوتیدها استفاده شود:

Tm = 81.5 + 16.6 × (log₁₀[Na⁺]) + 0.41 × (%G + %C) – 675/n

که در آن [Na⁺] غلظت مولاری نمک و n تعداد پایه‌های الیگونوکلئوتید است.

مثال: برای محاسبهٔ Tm یک الیگونوکلئوتید ۲۲‑مری با ۶۰ % G+C در ۵۰ mM KCl:

Tm = 81.5 + 16.6 × (log₁₀[0.05]) + 0.41 × (60) – 675/22
= 81.5 + 16.6 × (–1.30) + 24.60 – 30.68 ≈ 54 °C

طول زمان گسترش، که ممکن است نیاز به بهینه‌سازی داشته باشد، به اندازه محصول PCR و پلیمراز DNA مورد استفاده بستگی دارد. به‌طور کلی، برای هر ۱ kb آمپلیکون، حدود ۱ دقیقه (حداقل زمان گسترش = ۱ دقیقه) برای پلیمرازهای DNA بدون پروف‌ریدینگ و ۲ دقیقه برای پلیمرازهای DNA با پروف‌ریدینگ کافی است. از زمان‌های گسترش بیش از حد طولانی خودداری کنید، زیرا می‌تواند احتمال بروز مصنوعات مرتبط با فعالیت اگزونوکلئاز ۵′→۳′ ذاتی پلیمراز DNA Taq را افزایش دهد (Longley et al. 1990؛ Bell و DeMarini 1991).

معمولاً PCR شامل ۲۵–۳۵ چرخه تقویت است. خطر بروز محصولات PCR ناخواسته با افزایش تعداد چرخه‌ها افزایش می‌یابد؛ بنابراین ما توصیه می‌کنیم فقط به تعداد چرخه‌های کافی برای تولید مقدار دلخواه محصول ادامه دهید. اگر محصولات تقویت غیر‌خاص قبل از رسیدن به مقدار کافی محصول هدف انباشته شوند، می‌توانید محصولات اولین واکنش را رقیق کنید و یک تقویت دوم با همان پرایمرها یا پرایمرهای تو در تو (nested primers) که به توالی‌های داخل محصول هدف چسبیده‌اند، انجام دهید.

تقویت‌کننده‌ها و افزودنی‌های PCR
افزودن عوامل تقویت‌کننده می‌تواند بازده محصول موردنظر را افزایش دهد یا تولید محصولات ناخواسته را کاهش دهد. انواع مختلفی از تقویت‌کننده‌ها وجود دارد که از مکانیزم‌های متفاوتی عمل می‌کنند. این مواد برای همهٔ PCRها مؤثر نیستند؛ اثرات مفید معمولاً به قالب و پرایمر خاص بستگی دارد و باید به‌صورت تجربی تعیین شود. برخی از عوامل تقویت‌کنندهٔ رایج در ادامه بررسی می‌شوند.

اضافه کردن بتائین، DMSO و فرم‌آمید می‌تواند هنگام تقویت قالب‌های غنی از GC یا قالب‌هایی که ساختارهای ثانویهٔ قوی تشکیل می‌دهند، مفید باشد؛ این ساختارها می‌توانند باعث توقف پلیمرازهای DNA شوند. قالب‌های غنی از GC به‌دلیل جداسازی ناکارآمد دو رشته DNA یا تمایل پرایمرهای GC‑غنی به تشکیل ساختارهای ثانویهٔ بین‌مولکولی مشکل‌ساز می‌شوند؛ این ساختارها با چسباندن پرایمر به قالب رقابت می‌کنند. بتائین انرژی لازم برای جداسازی رشته‌های DNA را کاهش می‌دهد (Rees et al. 1993). DMSO و فرم‌آمید به‌نظر می‌رسد به‌صورت مشابه عمل کنند؛ آن‌ها با اختلال در تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته DNA به تقویت کمک می‌کنند (Geiduschek و Herskovits 1961).

در برخی واکنش‌ها که بدون تقویت‌کننده به‌خوبی تقویت نمی‌شوند، افزودن بتائین (۱ M)، DMSO (۱–۱۰ %) یا فرم‌آمید (۱–۱۰ %) می‌تواند بازده محصول PCR را افزایش دهد. غلظت‌های DMSO بالاتر از ۱۰ % و فرم‌آمید بالاتر از ۵ % می‌توانند پلیمراز DNA Taq و احتمالاً سایر پلیمرازهای DNA را مهار کنند (Varadaraj و Skinner 1994).

در برخی موارد، عوامل تثبیت‌کنندهٔ کلی مانند BSA (۰.۱ mg/ml)، ژلین (۰.۱–۱.۰ %) و مواد شویندهٔ غیر یونی (۰–۰.۵ %) می‌توانند شکست تقویت را برطرف کنند. این افزودنی‌ها می‌توانند پایداری پلیمراز DNA را افزایش دهند و از دست رفتن مواد واکنش به دلیل جذب به دیواره لوله جلوگیری کنند. BSA همچنین نشان داده شده است که اثر مهارکنندهٔ ملانین بر RT‑PCR را خنثی می‌کند (Giambernardi et al. 1998). مواد شویندهٔ غیر یونی مانند Tween®‑20، NP‑40 و Triton® X‑100 علاوه بر این مزیت، می‌توانند اثر مهارکنندهٔ مقادیر ردیفی از مواد شویندهٔ یونی قوی مانند ۰.۰۱ % SDS را خنثی کنند (Gelfand و White 1990). یون‌های آمونیوم می‌توانند واکنش تقویت را در شرایط غیر بهینه تحمل‌پذیرتر کنند؛ به همین دلیل برخی واکنش‌های PCR شامل ۱۰–۲۰ mM (NH₄)₂SO₄ هستند. سایر تقویت‌کننده‌های PCR شامل گلیسرول (۵–۲۰ %)، پلی‌اتیلن‌گلیکول (۵–۱۵ %) و تترا متیل آمونیوم کلراید (۶۰ mM) می‌باشند.

آلودگی متقاطع اسید نوکلئیک
مهم است که آلودگی متقاطع بین نمونه‌ها به حداقل برسد و انتقال RNA و DNA از یک آزمایش به آزمایش دیگر جلوگیری شود. از مناطق کاری جداگانه و پپی‌ت‌ورهای جداگانه برای مراحل پیش و پس از تقویت استفاده کنید. از پپی‌ت‌ورهای جابجایی مثبت یا سرنخ‌های مقاوم در برابر آئروسل استفاده کنید تا آلودگی در حین پپی‌ت‌زنی کاهش یابد. دستکش بپوشید و آن‌ها را به‌طور مکرر تعویض کنید.

روش‌های متعددی برای جلوگیری از تقویت DNA آلوده وجود دارد. می‌توان واکنش‌های PCR را با isopsoralen، یک عامل متقاطع‌ساز فعال با نور که به DNA دو‌رشته‌ای می‌پیوندد و پیوندهای متقاطع کووالانسی بین رشته‌ها ایجاد می‌کند، درمان کرد؛ این پیوندهای متقاطع باعث می‌شوند DNA نتواند جداسازی و تکثیر شود. درمان واکنش‌های PCR با uracil‑N‑glycosylase (UNG)، یک آنزیم تعمیر DNA که پیوند قند‑باز را در باقی‌مانده‌های اوراسیل هیدرولیز می‌کند، یکی دیگر از روش‌های مؤثر برای جلوگیری از آلودگی DNA قبلی است. UNG مانع تکثیر DNA حاوی اوراسیل می‌شود؛ زیرا پلیمراز DNA در سایت‌های خالی متوقف می‌شود. برای اینکه UNG مؤثر باشد، محصولات تقویت قبلی باید در حضور dUTP ساخته شوند؛ این کار به‌راحتی با جایگزینی dUTP به‌جای dTTP در واکنش انجام می‌شود. پلیمرازهای DNA بدون پروف‌ریدینگ به‌راحتی dUTP را در محصول PCR وارد می‌کنند، در حالی که پلیمرازهای DNA با پروف‌ریدینگ dUTP را به‌مراتب کمتر وارد می‌کنند (Slupphaug et al. 1993؛ Greagg et al. 1999؛ Lasken et al. 1996). چون وارد شدن dUTP تأثیری بر شدت رنگ‌آمیزی اتیوم‑بروم یا مهاجرت الکتروفورزی محصول PCR ندارد، واکنش‌ها می‌توانند به‌صورت استاندارد با ژل آگاروز تجزیه شوند. هر دو روش مؤثر هستند (Rys و Persing 1993)، اما UNG این مزیت را دارد که هر دو قالب DNA تک‌رشته‌ای و دو‑رشته‌ای را غیرقابل تقویت می‌کند (Longo et al. 1990).

ملاحظات کلی برای RT‑PCR
لطفاً ملاحظات کلی برای بهینه‌سازی PCR (در بالا) را نیز مطالعه کنید؛ بسیاری از پارامترهای مهم آن نیز برای RT‑PCR اعمال می‌شوند. برای بحث دربارهٔ رونویسی معکوس‌های معمولاً در RT‑PCR استفاده‌شده، به بخش «پلیمرازهای مقاوم به حرارت و رونویسی معکوس» (در ادامه) مراجعه کنید.

ملاحظات قالب
در RT‑PCR، موفقیت رونویسی معکوس به یکپارچگی و خلوص RNA بستگی دارد. روش‌های ایجاد و حفظ محیطی بدون RNase (بدون رینوزیما) برای کاهش تجزیه RNA در Blumberg 1987 توصیف شده‌اند. استفاده از یک مهارکنندهٔ RNase (مانند Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor) به‌شدت توصیه می‌شود. برای نتایج بهینه، قالب RNA—چه کل RNA، چه جمعیت mRNA یا رونوشت RNA سنتز شده—باید بدون DNA باشد تا از تقویت DNA آلوده جلوگیری شود. اکثر پلیمرازهای DNA مورد استفاده در PCR فعالیت رونویسی معکوس ندارند؛ بنابراین محصولات تقویت فقط در صورت وجود مقادیر ردیفی DNA در قالب تولید می‌شوند.

RT‑PCR موفق همچنین به مقدار RNA وابسته است؛ ممکن است نیاز باشد مقدار RNA را تغییر دهید تا مقدار بهینه پیدا شود. نتایج تقویت عالی می‌تواند با سیستم‌های Access و AccessQuick™ RT‑PCR با سطوح قالب RNA کل در محدودهٔ ۱ pg–۱ µg در هر واکنش (شکل 3) یا سطوح قالب RNA پلی(A)+ در محدودهٔ ۱ pg–۱۰۰ ng به‌دست آید.

شکل 3. تقویت یک پیام خاص در RNA کل. تقویت‌های RT‑PCR حاوی مقادیر مشخصی از RNA کل کبد موش با استفاده از سیستم Access RT‑PCR انجام شد؛ پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی خاص برای رونوشت β‑actin موش استفاده شد. آمپلیکون خاص ۵۴۰ bp نشان داده شده است. مقادیر مساوی از هر واکنش تقویت بر روی ژل ۳ % NuSieve®/۱ % آگاروز در بافر 1X TAE حاوی ۰.۵ µg/ml اتیوم‑بروم الکتروفورز شد. خطوط M، نردبان DNA ۱۰۰ bp (Cat.# G2101).

طراحی پرایمرهای رونویسی معکوس
انتخاب پرایمر مناسب برای رونویسی معکوس به اندازه mRNA هدف و حضور ساختار ثانویه بستگی دارد. به‌عنوان مثال، پرایمر که به‌طور خاص به انتهای ۳′ رونوشت می‌چسبد (پرایمر توالی‑خاص یا پرایمر oligo(dT)) ممکن است هنگام رونویسی معکوس انتهای ۵′ mRNAهای طولانی یا مولکول‌هایی که ساختار ثانویهٔ قابل‌توجهی دارند، مشکل‌ساز باشد؛ این ساختارها می‌توانند باعث توقف رونویسی معکوس شوند. هگزامرهای تصادفی در نقاط متعدد رونوشت رونویسی معکوس می‌کنند؛ به همین دلیل برای mRNAهای طولانی یا رونوشت‌های دارای ساختار ثانویهٔ قابل‌توجه مفید هستند.

هر زمان ممکن باشد، ما توصیه می‌کنیم از پرایمرهایی استفاده کنید که فقط به توالی‌های تعریف‌شده در RNAهای خاص (پرایمرهای توالی‑خاص) چسبیده شوند، نه به کل جمعیت RNA در نمونه (مانند هگزامرهای تصادفی یا پرایمر oligo(dT)). برای تمایز بین تقویت cDNA و تقویت DNA ژنومی آلوده، پرایمرها را طوری طراحی کنید که به توالی‌های درون اگزون‌ها در دو طرف یک اینترون چسبیده شوند؛ به این ترتیب هر محصولی که از DNA ژنومی حاصل شود، بسیار بزرگ‌تر از محصول تقویت‌شده از cDNA هدف خواهد بود. این اختلاف اندازه نه تنها تشخیص دو محصول را با الکتروفورز آسان می‌کند، بلکه تقویت محصول کوچکتر cDNA را نیز ترجیح می‌دهد (تقویت قطعات کوتاه‌تر معمولاً کارآمدتر از طولانی‌هاست).

صرف‌نظر از انتخاب پرایمر، غلظت نهایی پرایمر در واکنش معمولاً در محدودهٔ ۰.۱–۱.۰ µM است؛ اما ممکن است نیاز به بهینه‌سازی داشته باشد. ما توصیه می‌کنیم برای بهینه‌سازی، غلظت نهایی ۱ µM پرایمر (۵۰ pmol در واکنش ۵۰ µl) را به‌عنوان نقطهٔ شروع در نظر بگیرید. اطلاعات بیشتر دربارهٔ طراحی پرایمرهای PCR در بخش «طراحی پرایمرهای PCR» ارائه شده است.

پارامترهای چرخه
سنتز مؤثر رشتهٔ اول cDNA می‌تواند در یک انکوباسیون ۲۰–۶۰ دقیقه‌ای در ۳۷–۴۵ °C با استفاده از AMV reverse transcriptase یا در ۳۷–۴۲ °C با استفاده از M‑MLV reverse transcriptase انجام شود. هنگام استفاده از AMV RT، ما توصیه می‌کنیم از پرایمر توالی‑خاص استفاده کنید و رونویسی معکوس را در ۴۵ °C به‌مدت ۴۵ دقیقه انجام دهید؛ دمای بالاتر اثر ساختار ثانویهٔ RNA را کاهش می‌دهد و سنتز cDNA کامل‌طول را تشویق می‌کند. سنتز رشتهٔ اول cDNA با هگزامرهای تصادفی و پرایمر oligo(dT) به‌ترتیب در دمای اتاق (۲۰–۲۵ °C) و ۳۷ °C انجام می‌شود.

سیستم‌های Access و AccessQuick™ RT‑PCR نیازی به جداسازی RNA قبل از شروع رونویسی معکوس ندارند. اگر مایل باشید، می‌توانید یک گام جداسازی را با انکوباسیون لولهٔ جداگانه حاوی پرایمرها و قالب RNA در ۹۴ °C به‌مدت ۲ دقیقه اضافه کنید. AMV reverse transcriptase را در ۹۴ °C انکوبه نکنید؛ در این دما غیرفعال می‌شود. سپس مخلوط قالب/پرایمر را به ۴۵ °C سرد کنید و به مخلوط RT‑PCR برای انکوباسیون استاندارد رونویسی معکوس در ۴۵ °C اضافه کنید. پس از رونویسی معکوس، ما توصیه می‌کنیم ۲ دقیقه در ۹۴ °C انکوبه کنید تا هیبرید RNA/cDNA جداسازی شود، AMV reverse transcriptase غیرفعال شود و AMV RT از cDNA جدا شود. گزارش شده است که غیرفعال‌سازی AMV reverse transcriptase برای به‌دست آوردن بازده بالای محصول تقویت ضروری است (Sellner et al. 1992؛ Chumakov 1994).

اکثر نمونه‌های RNA می‌توانند با ۳۰–۴۰ چرخه تقویت شناسایی شوند. اگر RNA هدف نادر باشد یا مقدار کمی از ماده اولیه موجود باشد، ممکن است نیاز به افزایش تعداد چرخه‌ها به ۴۵ یا ۵۰ یا رقیق‌کردن محصولات اولین واکنش و تقویت مجدد باشد.

پلیمرازهای مقاوم به حرارت و رونویسی معکوس
پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت
قبل از استفاده از پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت در PCR، پژوهشگران مجبور بودند پس از هر چرخه جداسازی، واکنش را با آنزیم تازه (مانند Klenow یا T4 DNA polymerase) تکمیل کنند. پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت انقلاب بزرگی در PCR ایجاد کردند؛ زیرا می‌توانند در دماهای بالای جداسازی مقاومت کنند. استفاده از پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت همچنین امکان استفاده از دماهای چسباندن بالاتر را فراهم کرد که سختی چسباندن پرایمرها را بهبود می‌بخشد.

پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت می‌توانند برای RT‑PCR تک‑آنزیمی یا دو‑آنزیمی استفاده شوند (Myers و Gelfand 1991؛ Chiocchia و Smith 1997). به‌عنوان مثال، پلیمراز DNA Tth می‌تواند به‌عنوان رونویسی معکوس در حضور Mn²⁺ برای RT‑PCR تک‑آنزیمی عمل کند (Myers و Gelfand 1991). تمام پلیمرازهای DNA ذکرشده در ادامه می‌توانند برای تقویت cDNA رشتهٔ اول تولیدشده توسط یک رونویسی معکوس، مانند AMV RT، در RT‑PCR دو‑آنزیمی استفاده شوند.

پلیمرازهای DNA مقاوم به حرارت می‌توانند به دو گروه تقسیم شوند: آنهایی که فعالیت ۳′→۵′ اگزونوکلئاز (پروف‌ریدینگ) دارند، مانند پلیمراز DNA Pfu، و آنهایی که فاقد این عملکرد هستند، مانند پلیمراز DNA Taq. این دو گروه تفاوت‌های مهمی دارند. پلیمرازهای DNA پروف‌ریدینگ به‌دلیل فعالیت ۳′→۵′ اگزونوکلئاز، دقیق‌تر هستند؛ این آنزیم می‌تواند نوکلئوتید نادرست وارد شده را حذف کند. وقتی محصول تقویت‌شده برای کلونینگ، بیان یا تجزیه جهش‌ها استفاده می‌شود، پلیمراز DNA Pfu انتخاب بهتری است زیرا وفاداری بالاتری دارد. اما برای PCR روتین که هدف فقط شناسایی محصول تقویت است، پلیمراز DNA Taq معمولاً استفاده می‌شود؛ زیرا بازده بالاتری دارد.

تقویت با پلیمرازهای DNA بدون پروف‌ریدینگ منجر به افزودن یک نوکلئوتید تک‌نقطه‌ای به انتهای ۳′ محصول PCR می‌شود، در حالی که استفاده از پلیمرازهای DNA پروف‌ریدینگ منجر به محصولات PCR با انتهای صاف می‌شود (Clark 1988؛ Hu 1993). این نوکلئوتید تک‌نقطه‌ای می‌تواند کلونینگ محصولات PCR را ساده‌تر کند.

پلیمرازهای DNA پروف‌ریدینگ همچنین در ترکیب با پلیمرازهای DNA بدون پروف‌ریدینگ یا نسخه‌های کوتاه شدهٔ N‑ترمینال پلیمراز DNA Taq برای تقویت قطعات طولانی DNA با دقت بالاتر نسبت به استفاده تنها از پلیمراز DNA بدون پروف‌ریدینگ استفاده می‌شوند (Barnes 1994؛ Cline et al. 1996).

پلیمراز DNA Taq
پلیمراز DNA Taq از Thermus aquaticus استخراج می‌شود و در حضور Mg²⁺، ترکیب پرایمر‑مستقل نوکلئوتیدها را به DNA دو‌رشته‌ای در جهت ۵′→۳′ کاتالیز می‌کند. این آنزیم فاقد فعالیت ۳′→۵′ اگزونوکلئاز است اما فعالیت ۵′→۳′ اگزونوکلئاز دارد.

پلیمراز DNA Taq برای اکثر کاربردهای PCR که به آنزیم با وفاداری بالا نیاز ندارند، مناسب است؛ مانند تشخیص توالی‌های خاص DNA یا RNA. نرخ خطای پلیمراز DNA Taq تقریباً ۱ × ۱۰⁻⁵ خطا/بازده است، اگرچه وفاداری تا حدی به شرایط واکنش وابسته است. وفاداری در pH پایین‌تر، غلظت منیزیم پایین‌تر و غلظت dNTP نسبتاً پایین‌تر کمی بالاتر است (Eckert و Kunkel 1990؛ Eckert و Kunkel 1991).

پلیمراز DNA Taq معمولاً برای تقویت محصولات PCR تا ۵ kb یا کمتر استفاده می‌شود. محصولات PCR در محدودهٔ ۵–۱۰ kb می‌توانند با پلیمراز DNA Taq تقویت شوند، اما اغلب به بهینه‌سازی بیشتری نسبت به محصولات کوچکتر نیاز دارند. برای محصولات بزرگ‌تر از حدود ۱۰ kb، ما توصیه می‌کنیم از آنزیم یا ترکیب آنزیم‌ها و شرایط واکنش طراحی‌شده برای PCR طولانی استفاده کنید.

پلیمراز DNA Taq یک آنزیم پردازشی با نرخ گسترش >۶۰ نوکلئوتید/ثانیه در ۷۰ °C است (Innis et al. 1988)، بنابراین یک گام گسترش ۱ دقیقه برای هر ۱ kb باید برای تولید محصولات PCR کامل‌طول کافی باشد. این آنزیم نیمه‌عمر ۴۰ دقیقه در ۹۵ °C دارد (Lawyer et al. 1993). چون پلیمراز DNA Taq یک پلیمراز بدون پروف‌ریدینگ است، محصولات PCR تولیدشده با آن معمولاً یک نوکلئوتید تک‌نقطه‌ای ۳′ (معمولاً A) دارند.

پلیمراز DNA Tfl
پلیمراز DNA Tfl ترکیب پرایمر‑مستقل نوکلئوتیدها را به DNA دو‌رشته‌ای در حضور Mg²⁺ کاتالیز می‌کند. در حضور Mn²⁺، پلیمراز DNA Tfl می‌تواند از RNA به‌عنوان قالب استفاده کند. پلیمراز DNA Tfl فعالیت ۵′→۳′ اگزونوکلئاز دارد اما فاقد فعالیت ۳′→۵′ اگزونوکلئاز است. این آنزیم معمولاً در PCR (Gaensslen et al. 1992) استفاده می‌شود؛ که فعالیت آن شبیه به پلیمراز DNA Taq است. پلیمراز DNA Tfl در سیستم‌های Access و AccessQuick™ RT‑PCR به‌کار می‌رود.

پلیمراز DNA Tth
پلیمراز DNA Tth ترکیب نوکلئوتیدها را به DNA دو‌رشته‌ای در جهت ۵′→۳′ در حضور MgCl₂ کاتالیز می‌کند. این آنزیم می‌تواند در حضور MnCl₂ از RNA به‌عنوان قالب استفاده کند (Myers و Gelfand 1991؛ Ruttimann et al. 1985). پلیمراز DNA Tth فعالیت ۵′→۳′ اگزونوکلئاز دارد اما فعالیت ۳′→۵′ اگزونوکلئاز قابل‌تشخیص ندارد. نرخ خطای پلیمراز DNA Tth به‌صورت ۷.۷ × ۱۰⁻⁵ خطا/بازده اندازه‌گیری شده است (Arakawa et al. 1996). پلیمراز DNA Tth می‌تواند DNA هدف را در حضور بافر اشباع‌شده با فنول (Katcher و Schwartz 1994) تقویت کند و گزارش شده است که نسبت به سایر پلیمرازهای مقاوم به حرارت در برابر مهارکننده‌های موجود در خون مقاوم‌تر است (Ehrlich et al. 1991؛ Bej و Mahbubani 1992).

پلیمراز DNA Tth معمولاً در PCR (Myers و Gelfand 1991؛ Carballeira et al. 1990) و RT‑PCR (Myers و Gelfand 1991؛ Chiocchia و Smith 1997) استفاده می‌شود. برای گسترش پرایمر، RT‑PCR و سنتز cDNA با قالب‌های RNA دارای ساختار ثانویهٔ پیچیده، دمای بالای واکنش پلیمراز DNA Tth می‌تواند مزیتی نسبت به رونویسی معکوس‌های رایج‌تر مانند AMV و M‑MLV داشته باشد. پلیمراز DNA Tth بازآفرینی شده نشان داده است که فعالیتی شبیه RNase H دارد (Auer et al. 1995).

پلیمراز DNA Pfu
پلیمراز DNA Pfu یکی از کم‌ترین نرخ خطا را در میان تمام پلیمرازهای DNA ترموفیلیک شناخته‌شده برای تقویت دارد؛ به‌دلیل فعالیت بالای ۳′→۵′ اگزونوکلئاز (Cline et al. 1996؛ Andre et al. 1997). برای کلونینگ و بیان DNA پس از PCR، پلیمراز DNA Pfu اغلب انتخاب برتر است. پلیمراز DNA Pfu می‌تواند به‌تنهایی قطعات DNA تا ۵ kb را با افزایش زمان گسترش به ۲ دقیقه برای هر کیلو‌بیس تقویت کند. همچنین در ترکیب با پلیمرازهای DNA فاقد پروف‌ریدینگ، مانند پلیمراز DNA Taq، برای دستیابی به قطعات تقویت طولانی‌تر نسبت به استفاده تنها از پلیمراز DNA Pfu استفاده می‌شود (Barnes 1994). با این حال، فعالیت پروف‌ریدینگ می‌تواند طول پرایمرها را کوتاه کند، که منجر به بازده کمتر و تقویت غیر‌خاص بیشتر می‌شود.

رونویسی معکوس‌ها
کشف رونویسی معکوس‌ها (یا DNA‑پلیمرازهای وابسته به RNA) و نقش آن‌ها در چرخهٔ زندگی ریتروویروس (Baltimore 1970؛ Temin و Mizutani 1970) دگما مولکولی DNA→RNA→پروتئین را تغییر داد. رونویسی معکوس از یک قالب RNA برای سنتز DNA استفاده می‌کند و مانند سایر پلیمرازهای DNA برای سنتز نیاز به پرایمر دارد. برای کاربردهای in vitro، پرایمر می‌تواند یا oligo(dT) باشد که به انتهای پلی(A)+ mRNAهای یوکاریوتی چسبیده می‌شود، هگزامرهای تصادفی که در طول RNA قالب پرایم می‌کنند، یا پرایمر توالی‑خاص که به توالی شناخته‌شده‌ای در RNA قالب چسبیده می‌شود. سپس پلیمراز DNA همانند پلیمرازهای DNA‑وابسته به DNA عمل می‌کند. رونویسی معکوس‌های معمولاً استفاده‌شده در زیست‌شناسی مولکولی شامل AMV reverse transcriptase، M‑MLV reverse transcriptase و M‑MLV reverse transcriptase بدون RNase H هستند؛ که همه این‌ها واکنش را در دماهای بهینه متفاوتی انجام می‌دهند (AMV 42 °C؛ M‑MLV 37 °C؛ M‑MLV RNase H‑منفی 42 °C).

برخی رونویسی معکوس‌ها همچنین فعالیت داخلی ۳′‑ یا ۵′‑exoribonuclease (RNase) دارند که معمولاً برای تجزیه قالب RNA پس از سنتز cDNA رشتهٔ اول استفاده می‌شود. عدم وجود فعالیت ۵′‑exoribonuclease (RNase H) ممکن است به تولید cDNAهای طولانی‌تر کمک کند (Berger et al. 1983).

برخی پلیمرازهای DNA‑وابسته به DNA نیز فعالیت رونویسی معکوس دارند که می‌توانند تحت شرایط خاص فعال شوند. به‌عنوان مثال، پلیمراز DNA Tth مقاوم به حرارت می‌تواند در حضور Mn²⁺ به‌جای Mg²⁺ فعالیت رونویسی معکوس داشته باشد.

AMV Reverse Transcriptase
AMV RT ترکیب DNA را با استفاده از قالب DNA، RNA یا هیبریدهای RNA:DNA سنتز می‌کند (Houts et al. 1979). AMV reverse transcriptase برای قالب‌های RNA با ساختار ثانویهٔ بالا به‌دلیل دمای واکنش بالاتر (تا ۵۸ °C) ترجیح داده می‌شود. AMV RT در کاربردهای متنوعی از جمله سنتز cDNA (Houts et al. 1979؛ Gubler و Hoffman 1983)، RT‑PCR و تقویت سریع انتهای cDNA (RACE؛ Skinner et al. 1994) استفاده می‌شود. اگرچه دمای بهینهٔ بالای (۴۲ °C) آن را برای سنتز cDNA با قالب‌های ساختار ثانویهٔ پیچیده انتخاب می‌کند، فعالیت RNase H نسبتاً بالای آن محدودیت‌هایی برای تولید cDNAهای طولانی (>۵ kb) ایجاد می‌کند. برای این قالب‌ها، M‑MLV RT یا M‑MLV RT بدون RNase H ممکن است گزینه بهتری باشد.

M‑MLV Reverse Transcriptase
M‑MLV RT یک پلی‌پپتید تک‌زنجیره‌ای، DNA‑پلیمراز وابسته به RNA است. این آنزیم همچنین در سطوح بالای آنزیم فعالیت DNA‑پلیمراز وابسته به DNA دارد (Roth et al. 1985). M‑MLV RT در کاربردهای متنوعی از جمله سنتز cDNA، RT‑PCR و RACE (Gerard 1983) استفاده می‌شود. فعالیت RNase H نسبتاً پایین‌تر نسبت به AMV RT باعث می‌شود M‑MLV RT انتخاب برتر برای تولید cDNAهای طولانی (>۵ kb) باشد (Sambrook و Russell 2001). با این حال، برای قالب‌های کوتاه با ساختار ثانویهٔ پیچیده، AMV RT یا M‑MLV RT بدون RNase H ممکن است به‌دلیل دمای بهینه بالاتر گزینه بهتری باشند. M‑MLV RT کمتر پردازش‌پذیر از AMV RT است؛ بنابراین ممکن است برای تولید همان مقدار cDNA به‌واحدهای بیشتری نیاز داشته باشد (Schaefer 1995).

M‑MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus
M‑MLV reverse transcriptase بدون RNase H یک DNA‑پلیمراز وابسته به RNA است که به‌صورت ژنتیکی تغییر یافته تا فعالیت RNase H مرتبط حذف شود؛ این فعالیت باعث تجزیه رشتهٔ RNA در هیبرید RNA:DNA می‌شود (Tanese و Goff 1988). عدم وجود فعالیت RNase H باعث می‌شود M‑MLV RNase H‑منفی انتخاب برتر برای تولید cDNAهای طولانی (>۵ kb) باشد. با این حال، برای قالب‌های کوتاه با ساختار ثانویهٔ پیچیده، AMV reverse transcriptase ممکن است بهتر باشد زیرا می‌تواند در دماهای بالاتر واکنش دهد.

دو فرم M‑MLV RNase H‑منفی وجود دارد: موتاسیون حذف (deletion mutant) و موتاسیون نقطه‌ای (point mutant). همان‌طور که از نامشان پیداست، در موتاسیون حذف یک توالی خاص در دامنه RNase H حذف شده است، در حالی که در موتاسیون نقطه‌ای یک نقطه‌گذاری در دامنه RNase H وارد شده است. در حالی که دمای واکنش پیشنهادی M‑MLV RT بومی ۳۷ °C است، موتاسیون حذف و نقطه‌ای در دماهای بالاتر (تا ۵۰ °C و ۵۵ °C به ترتیب) پایدارتر هستند؛ این به پرایمرهای رونویسی معکوس مورد استفاده بستگی دارد. معمولاً موتاسیون نقطه‌ای نسبت به موتاسیون حذف ترجیح داده می‌شود؛ زیرا فعالیت DNA‑پلیمراز آن تقریباً برابر با آنزیم M‑MLV بومی است، در حالی که موتاسیون حذف کمی فعالیت DNA‑پلیمراز کمتری دارد (شکل 4).

شکل 4. مقایسهٔ مقدار کل cDNA سنتزشده از ۲ µg یک قالب RNA ۷.۵ kb با افزایش مقادیر سه رونویسی معکوس M‑MLV. هر واکنش cDNA رشتهٔ اول با ۲ µg قالب RNA ۷.۵ kb (۱ µl)، ۰.۵ µg پرایمر oligo(dT)15 (۱ µl) و ۱۴ µl آب انجام شد. RNA و پرایمر oligo(dT)15 در ۷۰ °C به‌مدت ۵ دقیقه گرم شد و سپس ۵ دقیقه روی یخ سرد شد. پنج میکرولیتر از بافر ۵X M‑MLV RT، ۱.۲۵ µl dNTPهای ۱۰ µM، ۰.۵ µl α‑32P dCTP (۱۰ µCi/µl، ۴۰۰ Ci/mmol) و ۲۵، ۵۰، ۱۰۰، ۱۵۰، ۲۰۰ یا ۴۰۰ واحد از M‑MLV Reverse Transcriptase RNase H‑Minus، Point Mutant؛ M‑MLV Reverse Transcriptase RNase H‑Minus، Deletion Mutant؛ یا M‑MLV Reverse Transcriptase بومی (RNase H+) در حجم نهایی ۲۵ µl استفاده شد. واکنش‌ها در ۴۲ °C به‌مدت ۶۰ دقیقه انکوبه شدند. رسوب‌گذاری TCA انجام شد و بازده cDNA رشتهٔ اول محاسبه شد.

محصولات پلیمرازهای مقاوم به حرارت و رونویسی معکوس
GoTaq® G2 DNA polymerase یک پلیمراز Taq کامل‑طول، بازآفرینی شده است که با بافرهای طراحی‌شده برای تقویت بهبود یافته عرضه می‌شود.

محصولات رونویسی معکوس شامل AMV، M‑MLV و GoScript—یک فرمولاسیون بهینه‌شدهٔ M‑MLV که سنتز cDNA قوی و قابل‌اعتماد از طیف وسیعی از رونوشت‌های نادر و فراوان، حتی با قالب‌های دشوار و در حضور مهارکننده‌های PCR فراهم می‌کند.

مشاهده محصولات Taq و لوازم جانبی مشاهده رونویسی معکوس‌ها و لوازم جانبی

نمونه پروتکل‌ها

نمونه پروتکل PCR انتهایی—GoTaq® G2 DNA Polymerase
مواد مورد نیاز

GoTaq® G2 DNA Polymerase و بافر واکنش (Cat.# M7841)
مخلوط نوکلئوتیدهای PCR (Cat.# C1141)
آب بدون نازاک (Cat.# P1193)
پرایمر بالا‌دست
پرایمر پایین‌دست
DNA قالب
روغن معدنی (اختیاری)

در یک لوله میکروسانتریفیوژ خالی، بدون نازاک، ترکیب‌های زیر را روی یخ ترکیب کنید:

| مؤلفه | حجم | غلظت نهایی |
| --- | --- | --- |
| 5X Green یا Colorless GoTaq® Reaction Buffer | 10 µl | 1X (1.5 mM MgCl₂) |
| مخلوط نوکلئوتیدهای PCR، 10 mM | 1 µl | 0.2 mM هر dNTP |
| پرایمر بالا‌دست | X µl | 0.1–1.0 µM |
| پرایمر پایین‌دست | Y µl | 0.1–1.0 µM |
| GoTaq® G2 DNA Polymerase (5 U/µl) | 0.25 µl | 1.25 U |
| DNA قالب | Z µl | <0.5 µg/50 µl |
| آب بدون نازاک | تا 50 µl |  |

1. کاملاً ذوب کنید و پیش از استفاده به‌خوبی تکان دهید.
2. می‌توانید با استفاده از محلول ۲۵ mM MgCl₂ (Cat.# A3511) MgCl₂ بیشتری به واکنش اضافه کنید.

اگر از سیکلر حرارتی بدون درپوش گرم استفاده می‌کنید، مخلوط واکنش را با 1–2 قطره (حدود ۵۰ µl) روغن معدنی بپوشانید تا از تبخیر در طول سیکل حرارتی جلوگیری شود. واکنش‌ها را به‌مدت ۵ ثانیه در میکروسانتریفیوژ سانتریفیوژ کنید.

واکنش‌ها را در سیکلر حرارتی که به 94–95 °C گرم شده است قرار دهید و PCR را آغاز کنید.

نمونه پروتکل RT: سنتز cDNA رشتهٔ اول
این روش می‌تواند تا 5 µg RNA کل یا تا 500 ng RNA پلی(A)+ را به cDNA رشتهٔ اول تبدیل کند.

مواد مورد نیاز

سیستم GoScript® Reverse Transcription (Cat.# M5000)
RNA آزمایشی با کیفیت بالا

قبل از استفاده، هر مؤلفه را مخلوط کنید و به‌سرعت سانتریفیوژ کنید. ترکیب‌های زیر را ترکیب کنید:

X µl RNA آزمایشی (تا 5 µg/واکنش)
پرایمر [Oligo(dT)15 (0.5 µg/واکنش) و/یا Random Primer (0.5 µg/واکنش) یا پرایمر توالی‑خاص (10–20 pmol/واکنش)]
X µl آب بدون نازاک تا حجم نهایی 5 µl

در یک بلوک حرارتی 70 °C به‌مدت 5 دقیقه گرم کنید. بلافاصله در آب یخ حداقل 5 دقیقه خنک کنید. 10 ثانیه در میکروسانتریفیوژ سانتریفیوژ کنید. تا زمان افزودن مخلوط رونویسی معکوس روی یخ نگه دارید.

مخلوط واکنش رونویسی معکوس را برای هر واکنش cDNA 15 µl آماده کنید. روی یخ ترکیب کنید به ترتیب زیر:

4.0 µl بافر 5X GoScript™
1.2–6.4 µl MgCl₂ (غلظت نهایی 1.5–5.0 mM)¹
1.0 µl مخلوط نوکلئوتیدهای PCR (غلظت نهایی 0.5 mM هر dNTP)²
20 واحد RNasin® Recombinant RNase Inhibitor (اختیاری)
1.0 µl GoScript™ Reverse Transcriptase
X µl آب بدون نازاک (تا حجم نهایی 15 µl)

¹ غلظت Mg²⁺ باید به 1.5–5.0 mM بهینه شود (MgCl₂ 25 mM عرضه می‌شود).
² اگر ترکیب ایزوتوپی یا غیر ایزوتوپی برای نظارت بر سنتز cDNA رشتهٔ اول مورد نیاز باشد، می‌توان α[32P]-dCTP یا نوکلئوتیدهای اصلاح‌شده دیگر را به مخلوط نوکلئوتیدها اضافه کرد.

15 µl مخلوط رونویسی معکوس را با 5 µl RNA و پرایمر ترکیب کنید. در بلوک حرارتی 25 °C به‌مدت 5 دقیقه آنیل کنید. در بلوک حرارتی 42 °C تا یک ساعت گسترش دهید.

واکنش‌ها می‌توانند در این مرحله برای تجزیه cDNA متوقف شوند یا برای ذخیره‌سازی طولانی‌مدت منجمد شوند.

غیرفعال‌سازی رونویسی معکوس: پیش از ادامه با qPCR، رونویسی معکوس را در بلوک حرارتی 70 °C به‌مدت 15 دقیقه غیرفعال کنید.

محصولات و منابع مرتبط با RT‑PCR
منابع

(سایر مراجع حذف شد)


تکنیکی که برای تکثیر یا ایجاد کپی‌های متعدد از یک ناحیه هدف خاص از DNA استفاده می‌شود.

نکات کلیدی:

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا PCR، تکنیکی برای ایجاد کپی‌های متعدد از یک ناحیه خاص از DNA به صورت in vitro (در لوله آزمایش و نه در یک ارگانیسم) است.
PCR به یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت، پلیمراز Taq، متکی است و به پرایمرهای DNA نیاز دارد که به طور خاص برای ناحیه مورد نظر DNA طراحی شده‌اند.
در PCR، واکنش به طور مکرر از طریق یک سری تغییرات دما چرخه‌ای می‌شود که امکان تولید کپی‌های متعددی از ناحیه هدف را فراهم می‌کند.
PCR کاربردهای تحقیقاتی و عملی بسیاری دارد. به طور معمول در کلونینگ DNA، تشخیص پزشکی و تجزیه و تحلیل قانونی DNA استفاده می‌شود.

PCR چیست؟
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) یک تکنیک آزمایشگاهی رایج است که برای ایجاد کپی‌های متعدد (میلیون‌ها یا میلیاردها!) از یک ناحیه خاص از DNA استفاده می‌شود. این ناحیه DNA می‌تواند هر چیزی باشد که آزمایش‌کننده به آن علاقه دارد. به عنوان مثال، ممکن است ژنی باشد که محقق بخواهد عملکرد آن را درک کند، یا یک نشانگر ژنتیکی که توسط متخصصان پزشکی قانونی برای مطابقت DNA صحنه جرم با مظنونین استفاده می‌شود.
به طور معمول، هدف از PCR ایجاد DNA کافی از ناحیه هدف است تا بتوان آن را تجزیه و تحلیل کرد یا به نحوی دیگر از آن استفاده کرد. به عنوان مثال، DNA تکثیر شده توسط PCR ممکن است برای تعیین توالی ارسال شود، با الکتروفورز ژل تجسم شود یا برای آزمایش‌های بیشتر در یک پلاسمید کلون شود.
PCR در بسیاری از زمینه‌های زیست‌شناسی و پزشکی، از جمله تحقیقات زیست‌شناسی مولکولی، تشخیص پزشکی و حتی برخی از شاخه‌های اکولوژی استفاده می‌شود.
پلیمراز Taq
مانند تکثیر DNA در یک ارگانیسم، PCR به یک آنزیم DNA پلیمراز نیاز دارد که رشته‌های جدید DNA را با استفاده از رشته‌های موجود به عنوان الگو تولید کند. DNA پلیمراز معمولاً مورد استفاده در PCR، پلیمراز Taq نامیده می‌شود، به نام باکتری مقاوم به حرارت که از آن جدا شده است (Thermus aquaticus).
T. aquaticus در چشمه‌های آب گرم و دریچه‌های حرارتی زندگی می‌کند. DNA پلیمراز آن بسیار پایدار در برابر حرارت است و در حدود 70 درجه سانتیگراد (دمایی که در آن DNA پلیمراز انسان یا E. coli غیرفعال است) بیشترین فعالیت را دارد. این پایداری حرارتی پلیمراز Taq را برای PCR ایده‌آل می‌کند. همانطور که خواهیم دید، از دمای بالا به طور مکرر در PCR برای دناتوره کردن DNA الگو یا جدا کردن رشته‌های آن استفاده می‌شود.
پرایمرهای PCR
مانند سایر DNA پلیمرازها، پلیمراز Taq فقط می‌تواند DNA را در صورتی تولید کند که یک پرایمر، یک توالی کوتاه از نوکلئوتیدها که یک نقطه شروع برای سنتز DNA فراهم می‌کند، به آن داده شود. در یک واکنش PCR، آزمایش‌کننده ناحیه DNA که کپی یا تکثیر می‌شود را با پرایمرهایی که انتخاب می‌کند تعیین می‌کند.
پرایمرهای PCR قطعات کوتاهی از DNA تک رشته‌ای هستند، معمولاً حدود 20 نوکلئوتید طول دارند. دو پرایمر در هر واکنش PCR استفاده می‌شود و به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در اطراف ناحیه هدف (ناحیه‌ای که باید کپی شود) قرار گیرند. یعنی، به آنها توالی‌هایی داده می‌شود که باعث می‌شود به رشته‌های مقابل DNA الگو، درست در لبه‌های ناحیه مورد کپی شدن، متصل شوند. پرایمرها از طریق جفت‌گیری باز مکمل به الگو متصل می‌شوند.
هنگامی که پرایمرها به الگو متصل می‌شوند، می‌توانند توسط پلیمراز گسترش یابند و ناحیه‌ای که بین آنها قرار دارد کپی می‌شود.
مراحل PCR
مواد کلیدی یک واکنش PCR، پلیمراز Taq، پرایمرها، DNA الگو و نوکلئوتیدها (بلوک‌های سازنده DNA) هستند. مواد در یک لوله جمع می‌شوند، همراه با کوفاکتورهای مورد نیاز آنزیم، و از طریق چرخه‌های مکرر گرم کردن و سرد کردن عبور می‌کنند که امکان سنتز DNA را فراهم می‌کند.

دناتوراسیون (96 درجه سانتیگراد): واکنش را به شدت گرم کنید تا رشته‌های DNA جدا یا دناتوره شوند. این الگوهای تک رشته‌ای را برای مرحله بعدی فراهم می‌کند.
اتصال (55 - 65 درجه سانتیگراد): واکنش را خنک کنید تا پرایمرها بتوانند به توالی‌های مکمل خود در DNA الگوی تک رشته‌ای متصل شوند.
افزایش (72 درجه سانتیگراد): دمای واکنش را افزایش دهید تا پلیمراز Taq پرایمرها را گسترش دهد و رشته‌های جدید DNA را سنتز کند.

این چرخه معمولاً 25 تا 35 بار در یک واکنش PCR معمولی تکرار می‌شود که به طور کلی 2 تا 4 ساعت طول می‌کشد، بسته به طول ناحیه DNA که کپی می‌شود. اگر واکنش کارآمد باشد (خوب کار کند)، ناحیه هدف می‌تواند از فقط یک یا چند کپی به میلیاردها برسد.
این به این دلیل است که نه تنها DNA اصلی است که هر بار به عنوان الگو استفاده می‌شود. در عوض، DNA جدیدی که در یک دور ساخته می‌شود می‌تواند به عنوان الگو در دور بعدی سنتز DNA عمل کند. کپی‌های زیادی از پرایمرها و مولکول‌های زیادی از پلیمراز Taq در واکنش وجود دارد، بنابراین تعداد مولکول‌های DNA می‌تواند تقریباً در هر دور چرخه‌ای دو برابر شود. این الگوی رشد نمایی در تصویر زیر نشان داده شده است.
استفاده از الکتروفورز ژل برای تجسم نتایج PCR
نتایج یک واکنش PCR معمولاً با استفاده از الکتروفورز ژل تجسم می‌شوند (قابل مشاهده می‌شوند). الکتروفورز ژل تکنیکی است که در آن قطعات DNA از طریق یک ماتریس ژل توسط جریان الکتریکی کشیده می‌شوند و قطعات DNA را بر اساس اندازه جدا می‌کند. معمولاً یک استاندارد یا نردبان DNA گنجانده می‌شود تا بتوان اندازه قطعات در نمونه PCR را تعیین کرد.
قطعات DNA با طول یکسان یک "باند" روی ژل تشکیل می‌دهند که می‌توان آن را با چشم دید اگر ژل با یک رنگ DNA-binding رنگ‌آمیزی شود. به عنوان مثال، یک واکنش PCR که یک قطعه 400 جفت باز (bp) تولید می‌کند، در ژل به این شکل به نظر می‌رسد:
یک باند DNA حاوی کپی‌های بسیار زیادی از ناحیه هدف DNA است، نه فقط یک یا چند کپی. از آنجایی که DNA میکروسکوپی است، باید کپی‌های زیادی از آن وجود داشته باشد تا بتوانیم آن را با چشم ببینیم. این بخش مهمی از دلیل اهمیت PCR به عنوان یک ابزار است: این ابزار کپی‌های کافی از یک توالی DNA تولید می‌کند تا بتوانیم آن ناحیه DNA را ببینیم یا دستکاری کنیم.
کاربردهای PCR
با استفاده از PCR، یک توالی DNA را می‌توان میلیون‌ها یا میلیاردها بار تکثیر کرد و DNA کافی برای تجزیه و تحلیل با استفاده از تکنیک‌های دیگر تولید کرد. به عنوان مثال، DNA ممکن است با الکتروفورز ژل تجسم شود، برای تعیین توالی ارسال شود یا با آنزیم‌های محدود کننده هضم و در یک پلاسمید کلون شود.
PCR در بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی استفاده می‌شود و همچنین کاربردهای عملی در پزشکی قانونی، آزمایش‌های ژنتیکی و تشخیص دارد. به عنوان مثال، PCR برای تکثیر ژن‌های مرتبط با اختلالات ژنتیکی از DNA بیماران (یا از DNA جنین، در مورد آزمایش‌های دوران بارداری) استفاده می‌شود. PCR همچنین می‌تواند برای آزمایش وجود یک باکتری یا ویروس DNA در بدن بیمار استفاده شود: اگر پاتوژن وجود داشته باشد، ممکن است بتوان مناطق DNA آن را از یک نمونه خون یا بافت تکثیر کرد.
مسئله نمونه: PCR در پزشکی قانونی
فرض کنید در یک آزمایشگاه پزشکی قانونی کار می‌کنید. شما به تازگی یک نمونه DNA از مویی که در صحنه جرم به جا مانده است و همچنین نمونه‌های DNA از سه مظنون دریافت کرده‌اید. وظیفه شما بررسی یک نشانگر ژنتیکی خاص و بررسی اینکه آیا هر یک از سه مظنون با DNA مو برای این نشانگر مطابقت دارد یا خیر است.
این نشانگر در دو آلل یا نسخه وجود دارد. یکی حاوی یک تکرار (ناحیه قهوه‌ای زیر) است، در حالی که دیگری حاوی دو کپی از تکرار است. در یک واکنش PCR با پرایمرهایی که ناحیه تکرار را احاطه می‌کنند، آلل اول یک قطعه DNA 200 جفت باز تولید می‌کند، در حالی که دومی یک قطعه 300 جفت باز تولید می‌کند:
شما PCR را بر روی چهار نمونه DNA انجام می‌دهید و نتایج را با استفاده از الکتروفورز ژل تجسم می‌کنید، همانطور که در زیر نشان داده شده است:
بیشتر در مورد PCR و پزشکی قانونی
در آزمایش‌های واقعی پزشکی قانونی DNA از صحنه جرم، تکنسین‌ها تجزیه و تحلیلی را انجام می‌دهند که از نظر مفهومی مشابه نمونه بالا است. با این حال، چندین نشانگر مختلف (نه فقط یک نشانگر در مثال) بین DNA صحنه جرم و DNA مظنونین مقایسه می‌شود.
همچنین، نشانگرهای مورد استفاده در تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی معمولی فقط در دو شکل مختلف وجود ندارند. در عوض، آنها بسیار چندریختی هستند (poly = many، morph = form). یعنی، آنها در بسیاری از آلل‌ها متفاوت هستند که در افزایش‌های جزئی طول متفاوت هستند.
رایج‌ترین نوع نشانگرهای مورد استفاده در پزشکی قانونی، که تکرارهای پشت سر هم کوتاه (STRs) نامیده می‌شوند، از تکرارهای متعدد یک توالی کوتاه نوکلئوتیدی یکسان (معمولاً 2 تا 5 نوکلئوتید طول) تشکیل شده‌اند. یک آلل از یک STR ممکن است 20 تکرار داشته باشد، در حالی که دیگری ممکن است 18 و دیگری فقط 101 داشته باشد.
با بررسی چندین نشانگر، هر کدام از انواع آلل‌های زیادی تشکیل شده‌اند، متخصصان پزشکی قانونی می‌توانند یک "اثر انگشت" ژنتیکی منحصر به فرد از یک نمونه DNA ایجاد کنند. در یک تجزیه و تحلیل STR معمولی با استفاده از 13 نشانگر، احتمال مثبت کاذب (دو نفر داشتن یک "اثر انگشت" DNA یکسان) کمتر از 1 در 10 میلیارد است!
اگرچه ممکن است فکر کنیم که شواهد DNA برای محکوم کردن مجرمان استفاده می‌شود، اما نقش مهمی در تبرئه افراد به اشتباه متهم (از جمله برخی که سال‌ها در زندان بوده‌اند) ایفا کرده است. تجزیه و تحلیل پزشکی قانونی همچنین برای تعیین پدری و شناسایی بقایای انسانی از صحنه‌های فاجعه استفاده می‌شود.


موضوعات
مفاهیم
علم شهروندی
توسعه حرفه‌ای معلم
واژه‌نامه
موضوعات
مفاهیم
علم شهروندی
توسعه حرفه‌ای معلم
واژه‌نامه
ورود به سیستم

اعلان‌ها
PCR مخفف یک روش ساده اما بسیار مفید در زیست‌شناسی مولکولی به نام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز است. این یک تکنیک برای تکثیر یک قطعه DNA مورد نظر یا تولید تعداد زیادی کپی است. به عبارت دیگر، PCR به شما امکان می‌دهد میلیون‌ها کپی از یک توالی DNA خاص را از یک نمونه اولیه کوچک - گاهی اوقات حتی یک کپی - تولید کنید. این یک فرآیند حیاتی برای طیف وسیعی از فناوری‌های ژنتیکی است و در واقع، منجر به توسعه مجموعه‌ای از فناوری‌های جدید شده است.
PCR چگونه کار می‌کند؟
PCR آنچه را که در سلول‌ها هنگام کپی‌برداری (تکثیر) DNA قبل از تقسیم سلولی اتفاق می‌افتد، تقلید می‌کند، اما در شرایط کنترل‌شده در آزمایشگاه انجام می‌شود. دستگاهی که استفاده می‌شود به سادگی دستگاه PCR یا ترموسایکلر نامیده می‌شود. لوله‌های آزمایش حاوی مخلوط DNA مورد نظر در دستگاه قرار می‌گیرند و دستگاه دما را برای مطابقت با هر مرحله از فرآیند تغییر می‌دهد.
مواد تشکیل‌دهنده استاندارد در مخلوط عبارتند از:

قطعه DNA مورد نظر
پرایمرهای خاص
آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت
چهار نوع مختلف نوکلئوتید DNA
نمک‌های مورد نیاز برای ایجاد یک محیط مناسب برای عملکرد آنزیم.

فرآیند PCR چیست؟
مرحله 1: دناتوراسیون
همانطور که در تکثیر DNA اتفاق می‌افتد، دو رشته در DNA دو رشته‌ای باید جدا شوند.
جداسازی با افزایش دمای مخلوط انجام می‌شود و باعث شکستن پیوندهای هیدروژنی بین رشته‌های DNA مکمل می‌شود. این فرآیند دناتوراسیون نامیده می‌شود.
مرحله 2: اتصال
پرایمرها به توالی‌های DNA هدف متصل می‌شوند و پلیمریزاسیون را آغاز می‌کنند. این فقط زمانی می‌تواند رخ دهد که دمای محلول کاهش یابد. یک پرایمر به هر رشته متصل می‌شود.
مرحله 3: گسترش
رشته‌های جدید DNA با استفاده از رشته‌های اصلی به عنوان الگو ساخته می‌شوند. یک آنزیم DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای DNA آزاد را به هم متصل می‌کند. این آنزیم اغلب پلیمراز Taq است، آنزیمی که در ابتدا از یک باکتری ترموفیلیک به نام Thermus aquaticus جدا شده است. ترتیبی که نوکلئوتیدهای آزاد اضافه می‌شوند توسط توالی نوکلئوتیدها در رشته DNA اصلی (الگو) تعیین می‌شود.
نتیجه یک چرخه PCR، دو توالی دو رشته‌ای DNA هدف است که هر کدام شامل یک رشته تازه ساخته شده و یک رشته اصلی هستند.
چرخه چندین بار (معمولاً 20-30 بار) تکرار می‌شود زیرا بیشتر فرآیندهایی که از PCR استفاده می‌کنند به مقادیر زیادی DNA نیاز دارند. به دست آوردن حدود یک میلیارد کپی تنها 2-3 ساعت طول می‌کشد.
فناوری PCR هنوز در حال توسعه است. توسعه و اصلاح مستمر فرآیندها و ابزارهای مورد استفاده وجود دارد که امکان تطبیق فرآیند را با نیازهای تخصصی فراهم می‌کند. به عنوان مثال، روش‌ها و اصلاحات جدیدی در حال توسعه و استفاده هستند، به ویژه زمانی که به کمی‌سازی DNA در یک نمونه نیاز است. روش‌های جدید شامل PCR بلادرنگ یا PCR کمی (qPCR) و PCR دیجیتال (dPCR) است. در qPCR، تکثیر DNA به صورت بلادرنگ نظارت می‌شود و امکان کمی‌سازی DNA هدف در طول فرآیند را فراهم می‌کند. dPCR یک رویکرد جدید و اصلاح‌شده است که فرآیند PCR را به مراحل کوچکتر تقسیم می‌کند. این دقت بیشتری، اندازه‌گیری‌های قابل اعتمادتر و کمی‌سازی مطلق از نمونه‌های بسیار کوچک یا مخلوط ارائه می‌دهد.
طبیعت علم
توسعه فناوری‌های جدید، مانند PCR، امکان کشف‌های جدید را فراهم می‌کند. فناوری‌های دیگر نیز می‌توانند توسعه یابند. برای برخی از نمونه‌هایی از نحوه استفاده از PCR و انواع تحقیقات و فرآیندهایی که به دلیل آن امکان‌پذیر است، به "PCR برای چه مواردی استفاده می‌شود؟" مراجعه کنید.
منتشر شده در 29 ژوئن 2017 مقالات مرجع
آیا مایل به شرکت در یک نظرسنجی کوتاه هستید؟
این نظرسنجی در یک برگه جدید باز می‌شود و می‌توانید پس از بازدید از سایت آن را پر کنید.


اکثر ما از چرخه فصلی شیوع آنفولانزا آگاه هستیم که برای آمریکایی‌ها در زمستان به اوج می‌رسد. میکائلا مارتینز، دکترای علوم، محقق در دانشکده بهداشت عمومی میلمن دانشگاه کلمبیا، در مقاله‌ای جدید استدلال می‌کند که همه بیماری‌های عفونی دارای یک عنصر فصلی هستند. این مقاله با عنوان "Pearl" در مجله PLOS Pathogens منتشر شده است.
مارتینز اطلاعاتی را از سازمان بهداشت جهانی، مراکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌های ایالات متحده و نشریات مورد بررسی همتایان جمع‌آوری کرد تا تقویمی از همه‌گیری‌ها برای ۶۹ بیماری عفونی، از عفونت‌های رایج تا بیماری‌های گرمسیری نادر، ایجاد کند. در یک سال مشخص، شاهد شیوع آنفولانزا در زمستان، آبله مرغان در بهار و سوزاک و فلج اطفال در تابستان خواهیم بود - تنها چند نمونه از شیوع‌های فصلی که به خوبی توصیف شده‌اند.
او دریافت که فصلی بودن نه تنها در بیماری‌های عفونی حاد مانند آنفولانزا، بلکه در بیماری‌های عفونی مزمن مانند هپاتیت B نیز رخ می‌دهد که بسته به جغرافیا، در زمان‌های خاصی از سال با تناوب بیشتری شعله‌ور می‌شود. مطالعات اولیه نشان داده است که حتی HIV-AIDS نیز دارای یک عنصر فصلی است که تصور می‌شود ناشی از تغییرات فصلی در سوءتغذیه در محیط‌های کشاورزی باشد.
این مقاله چهار عامل اصلی فصلی بودن در بیماری‌های عفونی را شرح می‌دهد. عوامل محیطی مانند دما و رطوبت، آنفولانزای فصلی را تنظیم می‌کنند؛ در بیماری‌های منتقله از طریق ناقل مانند زیکا نیز، محیط در تکثیر پشه‌ها نقش دارد. رفتارهای میزبان مانند نزدیک شدن کودکان به یکدیگر در طول سال تحصیلی، عاملی در سرخک است. عوامل اکولوژیکی مانند جلبک‌ها در شیوع وبا نقش دارند. ریتم‌های بیولوژیکی فصلی، مشابه مواردی که مهاجرت و خواب زمستانی حیوانات را کنترل می‌کنند، ممکن است در بیماری‌هایی مانند فلج اطفال نیز نقش داشته باشند، اگرچه تحقیقات بیشتری مورد نیاز است.
مارتینز، استادیار علوم بهداشت محیط، می‌گوید: «فصلی بودن یک ویژگی قدرتمند و فراگیر در بیماری‌های عفونی است، اگرچه جامعه علمی تا حد زیادی آن را برای اکثر عفونت‌ها نادیده گرفته است.» او ادامه می‌دهد: «برای درک نیروهای محرک فصلی بودن بیماری‌ها و نحوه استفاده از فصلی بودن برای طراحی مداخلات برای پیشگیری از شیوع و درمان عفونت‌های مزمن، کار زیادی باید انجام شود.»
شناسایی عوامل محرک شیوع‌های فصلی همیشه آسان نیست، اما می‌تواند سودمند باشد. به عنوان مثال، باکتری‌هایی که باعث وبا می‌شوند و از طریق مدفوع-دهانی به انسان منتقل می‌شوند، می‌توانند در آب پشتیبانی شده توسط جلبک‌ها حفظ شوند. مقامات بهداشت عمومی ممکن است مداخله‌ای را برای جلوگیری از انتقال وبا از افراد آلوده و/یا هدف قرار دادن باکتری‌های زنده در توده‌های آبی پر از جلبک انجام دهند؛ مهم این است که فصل کلیدی برای انجام هر یک از این مداخلات احتمالاً متفاوت خواهد بود.
در مورد فلج اطفال، محققان بهداشت عمومی زمانی فکر می‌کردند که شیوع‌های تابستانی ناشی از اختلاط فصلی کودکان در استخرها یا تئاترها یا آب و هوا باشد، اما هیچ یک از این عوامل نمی‌توانستند شیوع‌های تابستانی در سراسر جهان را توضیح دهند. در سال ۲۰۰۱، محقق در CDC فرضیه‌ای را مطرح کرد که تغییرات فصلی در هورمون ملاتونین ممکن است نقش مهمی در تعدیل سیستم ایمنی داشته باشد. مارتینز در حال حاضر در حال بررسی این احتمال با مقایسه سطوح مولکول‌های ایمنی در خون گرفته شده از بیماران در زمان‌های مختلف سال است که توسط یک کمک مالی معتبر از National Institutes of Health Director’s Grant تأمین می‌شود.


فصلی بودن بیماری‌های عفونی

فصلی بودن به عنوان یک ویژگی مهم در بسیاری از بیماری‌های عفونی از اهمیت بهداشتی عمومی شناخته شده است. بسیاری از ما با شیوع دوره‌ای آنفولانزا در زمستان، آبله مرغان در بهار و فلج اطفال که زمانی بسیار ترسناک بود در تابستان آشنا هستیم. در واقع، محققان نشان داده‌اند که برخی از بیماری‌های عفونی الگوهای فصلی از خود نشان می‌دهند که منجر به افزایش دوره‌ای بروز بیماری می‌شود که با فصل‌ها یا سایر شرایط سالانه همپوشانی دارد. اگرچه مکانیسم‌های دقیق زیربنایی فصلی بودن بسیاری از بیماری‌های عفونی هنوز تا حد زیادی نامشخص است، مطالعات اخیر شواهدی را نشان داده‌اند که نشان می‌دهد هر بیماری عفونی حاد ممکن است پنجره زمانی خاص خود را در طول سال داشته باشد. علاوه بر بیماری‌های عفونی حاد، یافته‌ها نشان داده‌اند که شیوع بیماری‌های عفونی مزمن نیز ممکن است تا حدی فصلی باشد.

طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی (WHO)، با وجود پیشرفت در واکسن‌ها، درمان‌ها و استراتژی‌های مدیریت عفونت، بیماری‌های عفونی مانند عفونت‌های تنفسی تحتانی، بیماری‌های اسهالی و سل در سال 2016 از جمله علل اصلی مرگ و میر در سراسر جهان بودند. بهبود درک ما از فصلی بودن بیماری‌های عفونی می‌تواند به زودی مزایای قابل توجهی برای بهداشت عمومی ایجاد کند. در ادامه، اطلاعات بیشتری در مورد فصلی بودن بیماری‌ها، علل احتمالی آن، پیامدهای آن برای پاندمی کووید-19 و اهمیت آن برای بهداشت عمومی کسب خواهید کرد.

فصلی بودن چیست؟

به گفته فیسمن (2007)، فصلی بودن به افزایش دوره‌ای بروز بیماری مربوط به فصل‌ها یا سایر دوره‌های تقویمی اشاره دارد. فصلی بودن یک ویژگی گسترده و حتی به طور بالقوه یکنواخت کننده برای بیماری‌های حاد و مستعد همه‌گیری است. در واقع، مطالعه‌ای توسط مارتینز (2018) مفهوم تقویم محلی همه‌گیری را بررسی می‌کند که ممکن است با همه‌گیری‌ها در غیاب اقدامات کنترلی مشخص شود. بر اساس داده‌های جمع‌آوری شده از سازمان بهداشت جهانی (WHO)، مراکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌های ایالات متحده (CDC) و مرکز اروپایی پیشگیری و کنترل بیماری‌ها (ECDC) که 69 بیماری عفونی را پوشش می‌دهد، مارتینز (2018) نشان داده است که حداقل 68 مورد از این بیماری‌های عفونی دارای ویژگی فصلی هستند. علاوه بر این، این مطالعه تعیین کرده است که مانند بیماری‌های عفونی حاد، برخی از بیماری‌های عفونی مزمن مانند هپاتیت B و HIV/AIDS نیز در دوره‌های خاصی از سال با نظم بیشتری رخ می‌دهند.

با این حال، این مطالعه همچنین تفاوت‌های قابل توجهی را در فصلی بودن بروز بیماری بر اساس موقعیت جغرافیایی نشان می‌دهد. به عنوان مثال، مارتینز خاطرنشان می‌کند که هپاتیت C در هند در زمستان و در بهار یا تابستان در مصر، چین و مکزیک به اوج می‌رسد. در مقابل، در حالی که فصل‌های خشک با بیماری کرم گینه و تب لاسا در نیجریه مرتبط است، این دوره با هپاتیت A در برزیل مرتبط است.

چه عواملی می‌توانند محرک‌های فصلی بودن باشند؟

پویایی‌های زیربنایی که فصلی بودن را شکل می‌دهند برای اکثر بیماری‌های عفونی که بر بهداشت عمومی تأثیر می‌گذارند به خوبی مورد بررسی و درک قرار نگرفته است. با این حال، بسیاری از مطالعات به روابط بین پاتوژن، محیط و رفتار انسان اشاره کرده‌اند تا فصلی بودن بیماری‌های مختلف را توضیح دهند. به گفته مارتینز (2018)، چهار محرک فصلی فصلی بودن عبارتند از عوامل محیطی، رفتار میزبان، پدیدارشناسی میزبان و عوامل بیوتیک خارجی. عوامل محیطی شامل شرایط آب و هوایی مانند دما، باران و رطوبت است که می‌تواند بر هر دو میزبان و پاتوژن تأثیر بگذارد. رفتار میزبان به فعالیت‌های انسانی اشاره دارد که ممکن است منجر به سطوح مختلف تماس و انتقال در طول سال شود. پدیدارشناسی میزبان، از سوی دیگر، تاریخچه زندگی میزبان، چرخه‌های سالانه و ریتم‌های دوره‌ای درونی را پوشش می‌دهد که ممکن است فیزیولوژی میزبان را تغییر دهد. در نهایت، عوامل بیوتیک خارجی شامل تعاملات بین میزبانان، مخازن و ناقلان است.

بنابراین، در حالی که پویایی‌های زیربنایی فصلی بودن با متغیرهای مخدوش کننده پیچیده‌تر می‌شود، این احتمال وجود دارد که آنفولانزا، به عنوان مثال، ممکن است در زمستان به دلیل ترکیبی از عوامل مختلف مانند رطوبت، دما، افزایش سطح تماس نزدیک بین افراد و کاهش سطح ویتامین D به اوج برسد. برای بیماری‌هایی مانند چیکونگونیا و تب دنگی، فصلی بودن را می‌توان تا حد زیادی با افزایش تعداد ناقلان در طول فصل‌های بارانی توضیح داد.

برای ویروس‌ها، از سوی دیگر، مطالعات بر تأثیر شرایط محیطی و قابلیت زنده ماندن خارج از بدن انسان تأکید می‌کنند. به گفته رامالینگم (2019)، به ویژه ویروس‌های پوشش‌دار به دلیل آسیب‌پذیری در برابر شرایط نامطلوب، فصلی بودن بسیار مشخصی را نشان می‌دهند. بر این اساس، در حالی که ویروس‌های پوشش‌دار مانند RSV، آنفولانزا و متانوویروس انسانی در ماه‌های زمستان به اوج می‌رسند و حدود سه ماه در سال در گردش هستند، ویروس‌های غیرپوشش‌دار مانند رینوویروس‌ها و آدنوویروس‌ها به مدت بیش از نیمی از سال در گردش هستند.

پیامدهای فصلی بودن برای پاندمی کووید-19 چیست؟

اگرچه یک ویروس پوشش‌دار است، اما هنوز هیچ یافته قطعی در مورد اینکه آیا SARS-CoV-2 ممکن است مانند آنفولانزا، RSV و سایر ویروس‌های پوشش‌دار از نظر فصلی بودن رفتار کند، وجود ندارد. اگرچه برخی از خواهر و برادرهای آن مانند SARS و MERS به اندازه کافی در گردش نبوده‌اند تا یک چرخه فصلی مشاهده شود، اما بیشتر کروناویروس‌های انسانی که باعث بیماری‌های تنفسی می‌شوند، فصلی بودن زمستانی را نشان داده‌اند. با این حال، کارشناسان هشدار می‌دهند که اجبار فصلی توسط عوامل متعددی شکل می‌گیرد و حتی اگر SARS-CoV-2 کاهش فصلی را نشان دهد، ممکن است با آلوده کردن افراد حساس برای مدت طولانی تداوم یابد.

اهمیت فصلی بودن برای بهداشت عمومی چیست؟

علاوه بر سوال فوری در مورد اینکه در مورد پاندمی مداوم چه انتظاری باید داشت، درک بهتر فصلی بودن می‌تواند به نظارت بر بیماری‌ها، پیش‌بینی‌های اپیدمیولوژیک و زمان‌بندی بهینه کمپین‌های واکسیناسیون کمک کند. داده‌های کافی و قابل اعتماد در مورد مکانیسم‌های زیربنایی که بیماری‌های عفونی را تقویت و محدود می‌کنند، می‌تواند از مقامات بهداشت عمومی در توسعه مداخلات کارآمدتر و نوآورانه‌تر حمایت کند. همچنین می‌توان آن را برای توسعه پیش‌بینی‌ها و مدل‌های دقیق‌تر و گسترده‌تر در پیش‌بینی همه‌گیری‌ها و فصل‌های بیماری به کار برد. در نهایت، درک عمیق‌تر از فصلی بودن بیماری می‌تواند به مقامات بهداشت عمومی کمک کند تا زمان‌بندی بهینه کمپین‌های واکسیناسیون و سایر اقدامات پیشگیرانه را برای اطمینان از حداکثر ایمنی قبل از شیوع بیماری تعیین کنند.

منابع

Fisman, D. N. (2007, April 1). Seasonality of Infectious Diseases. Annual Review of Public Health, 28(1), 127–143. https://doi.org/10.1146/annurev.publhealth.28.021406.144128
Kandeel, A., Dawson, P., Labib, M., Said, M., El-Refai, S., El-Gohari, A., & Talaat, M. (2016, September 8). Morbidity, Mortality, and Seasonality of Influenza Hospitalizations in Egypt, November 2007-November 2014. PLOS ONE, 11(9), e0161301. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161301
Martinez, M. E. (2018, November 8). The calendar of epidemics: Seasonal cycles of infectious diseases. PLOS Pathogens, 14(11), e1007327. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007327
Price, R. H. M., Graham, C., & Ramalingam, S. (2019, January 30). Association between viral seasonality and meteorological factors. Scientific Reports, 9(1). https://doi.org/10.1038/s41598-018-37481-y
Zhang, X., Zhang, T., Young, A. A., & Li, X. (2014, February 5). Applications and Comparisons of Four Time Series Models in Epidemiological Surveillance Data. PLoS ONE, 9(2), e88075. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0088075


فهرست مجلات
Int J Prev Med
جلد 4(2)؛ فوریه 2013
PMC3604842

چکیده
شناخت الگوهای فصلی در بروز بیماری‌های عفونی حداقل به دوران هیپوکرات برمی‌گردد، اما مکانیسم‌های زیربنایی این نوسانات هنوز به خوبی درک نشده‌اند. فرضیه‌های مکانیسمی متعددی برای توضیح فصلی بودن بیماری‌های مختلف منتقله مستقیم پیشنهاد شده است، از جمله حداقل موارد زیر: فعالیت انسانی، تغییرات فصلی در عملکرد سیستم ایمنی بدن انسان، تغییرات فصلی در سطوح ویتامین D، فصلی بودن ملاتونین و عفونت‌زایی عوامل بیماری‌زا. در این مقاله کوتاه به طور خلاصه نقش این عوامل در الگوهای فصلی بیماری‌های عفونی مورد بحث قرار خواهد گرفت.
واژه‌های کلیدی: بیماری‌ها، فعالیت انسانی، عفونت، فصل
مقدمه
بسیاری از بیماری‌های عفونی زمانی که هوا سرد است و مردم در خانه‌های بسته زندگی می‌کنند، شیوع می‌یابند و با گرم‌تر شدن هوا و خروج مردم از خانه‌ها و تهویه منازلشان کاهش می‌یابند. مکانیسم‌های زیربنایی این نوسانات هنوز به خوبی درک نشده‌اند. آیا سرما است؟ هوای خشک؟ ازدحام جمعیت در داخل خانه‌ها در زمستان؟ شناسایی دلایل فصلی بودن بیماری‌های عفونی می‌تواند امکان اقدامات پیشگیرانه را فراهم کند و حتی به توسعه سیاست‌های موثر و استفاده بهینه از منابع کمک کند.[1]
در این مقاله کوتاه به طور خلاصه به مهم‌ترین عوامل موثر بر الگوهای فصلی بیماری‌های عفونی اشاره خواهیم کرد و مروری بر اپیدمیولوژی بیماری‌های عفونی فصلی ارائه خواهیم داد. این مقاله به پنج بخش و یک نتیجه‌گیری تقسیم شده است. بخش اول اطلاعات خلاصه ای در مورد تغییرات فصلی در فعالیت بدنی انسان و ارتباط آن با روش‌های مختلف انتقال بیماری‌های عفونی انسان ارائه می‌دهد. بخش دوم مروری بر تغییرات فصلی محیطی و حفظ عفونت‌زایی عوامل بیماری‌زا ارائه می‌دهد. بخش سوم به تغییرات فصلی در عملکرد سیستم ایمنی می‌پردازد. در بخش‌های چهارم و پنجم، پیوندهای احتمالی بین تغییرات فصلی در سطوح ویتامین D و ملاتونین در الگوهای فصلی بیماری‌های عفونی مورد بحث قرار می‌گیرد.
فعالیت انسانی
عوامل بیماری‌زا محیط‌های شلوغ را ترجیح می‌دهند. با شروع هوای سردتر، مردم بیشتر وقت خود را در داخل خانه‌ها می‌گذرانند. تهویه نامناسب و طراحی ضعیف در مکان‌های عمومی شلوغ و سیستم‌های حمل و نقل شهری ممکن است باعث افزایش قرار گرفتن در معرض عوامل بیماری‌زای موجود در هوا شود. علاوه بر این، رطوبت نسبی بالاتر نیز می‌تواند بر پایداری قطرات موجود در هوا که عوامل بیماری‌زا از طریق آن‌ها منتقل می‌شوند، تأثیر بگذارد. به عنوان مثال، انتقال ویروس آنفولانزا از طریق قطرات در فصول سردتر و مرطوب‌تر افزایش می‌یابد. در بسیاری از کشورها، شروع هوای سردتر و مرطوب‌تر با تجمع بیشتر مردم و تشدید اثر فصلی همراه است. وبا که در فصل گرم شایع‌تر است، به نظر می‌رسد به توانایی ویبریوها برای رشد سریع در دماهای محیطی گرم مرتبط باشد و غیره. با این حال، بیماری‌ها به تقویم نگاه نمی‌کنند. بروز و کاهش آن‌ها به دلیل تغییرات در عوامل مرتبط با بیماری‌ها است. در همه فرهنگ‌ها، بیشتر مراسم اجتماعی با تقویم هماهنگ می‌شوند و معمولاً همه تقویم‌ها ریتم چرخه‌ای طبیعت را منعکس می‌کنند. جشن‌های اجتماعی یا گردهمایی‌های مردمی که توسط جوامع بر اساس تقویم برگزار می‌شود، برای مثال. افزایش تماس بین کودکان در زمان مدرسه یا در اردوهای تابستانی، که منعکس کننده تقویم مدارس است، و همچنین زمان برخی از بیماری‌های عفونی مرتبط با آن است.[2]
فعالیت بدنی انسان در تابستان و بهار در مقایسه با زمستان بیشتر است. در یک مطالعه مشاهده شد که اکثریت استرالیایی‌ها و آلمانی‌ها در زمستان سطح فعالیت بدنی خود را کاهش می‌دهند، به ویژه در رابطه با فعالیت یا کار در فضای باز.[3] از این رو می‌توان نتیجه گرفت که آب و هوا تأثیر متوسطی بر فعالیت بدنی جمعیت دارد. علاوه بر این، بزرگی تأثیر آب و هوا بر شرایط اقتصادی-اجتماعی است. آب و هوا به عنوان مانعی برای فعالیت بدنی و ارتباطات اجتماعی عمل می‌کند. یک مطالعه انجام شده در ژاپن نشان می‌دهد که فعالیت بدنی با گرم‌تر شدن دما تا 17 درجه سانتیگراد افزایش می‌یابد و سپس با کاهش دما کاهش می‌یابد.[4]
سبک‌های پوشاک فصلی به دلیل شرایط آب و هوایی، گامی در جهت سازگاری با محیط است. پوشیدن لباس‌های سنگین در زمستان و لباس‌های کمتر در تابستان و بهار نیز تأثیر قابل توجهی بر تغییرات فصلی در رفتار انسان دارد. چندین مطالعه نشان می‌دهد که سبک‌های پوشاک که تمام بدن را می‌پوشانند، اثرات نامطلوبی بر غلظت ویتامین D دارند و می‌توانند به دلیل قرار گرفتن محدود سطح پوست در معرض نور خورشید منجر به کمبود ویتامین D شوند. برای برآوردن نیاز به ویتامین D تبدیل شده از نور خورشید، مهم است که آسیب پذیرترین نواحی بدن مانند بازوها، پاها و صورت حداقل دو یا سه بار در هفته در معرض نور خورشید قرار گیرند.[5]
عفونت‌زایی عوامل بیماری‌زا
"حفظ عفونت‌زایی هر عامل بیماری‌زا در خارج از میزبان به عوامل متعددی از جمله دما، رطوبت، کم‌آبی و نور ماوراء بنفش بستگی دارد. دما بیشترین تأثیر را دارد، زیرا سرعت بیشتر فرآیندهای شیمیایی و فیزیکی به آن بستگی دارد".[6]
می‌توان فرض کرد که بروز بیماری‌های عفونی توسط تغییرات فصلی محیطی به طور مستقیم بر فراوانی، بقا یا ویرولانس عوامل بیماری‌زا هدایت می‌شود.[7]، زیرا تغییرات سالانه در چرخه فصلی با تغییرات در محیط فیزیکی مانند دما، غلظت اکسیژن و رطوبت همراه است. به عنوان مثال، برخی از میکروارگانیسم‌ها مانند سویه‌های E. coli در شرایط کم رطوبت پایدارتر و در شرایط رطوبت بالا به طور قابل توجهی ناپایدارتر هستند. ویروس‌ها (به عنوان مثال، ویروس‌های فلج اطفال) بدون لیپیدهای ساختاری در شرایط رطوبت بالا پایدارتر هستند، در حالی که ویروس‌ها (آنفولانزا و واکسینیا) با لیپیدهای ساختاری کمترین پایداری را دارند. ویروس‌های آبله می‌توانند به مدت چندین ماه در شرایط طبیعی داخل خانه زنده بمانند.
در مورد Mycobacterium tuberculosis، مطالعات مشاهده‌ای نشان داده‌اند که آن‌ها در پاسخ به تغییرات دما در محیط اطراف، تغییراتی در دیواره سلولی ایجاد می‌کنند.[8] مطالعات نشان می‌دهند که ترکیب پیچیده دیواره سلولی میکوباکتریوم که حاوی موم‌ها، گلیکوپروتئین‌ها و گلیکولیپیدها است، مسئول ویرولانس میکوباکتریوم است و به آن توانایی زنده ماندن در شرایط سخت محیطی مانند کم‌آبی یا افزایش دما را می‌دهد. با این حال، اطلاعات بسیار کمی در مورد مکانیسم‌هایی که میکوباکتریوم‌ها از طریق آن‌ها بیان اجزای دیواره سلولی را در پاسخ به تغییرات محیطی مانند استرس اکسیداتیو، رشد، بی‌هوازی، محرومیت از مواد مغذی و تغییرات دما تنظیم می‌کنند، وجود دارد.[8]
عملکرد سیستم ایمنی
تغییرات فصلی و عوامل محیطی مانند دما، نور خورشید، باران، باد و رطوبت ارتباط مستقیمی با افزایش تعداد بیماری‌های عفونی دارند. به عنوان مثال، می‌توان به افزایش اپیدمی مننژیت در آفریقای زیر صحرا در فصل بادهای خشک و پایان آن با شروع باران‌ها اشاره کرد. به طور مشابه، همه‌گیری ویروس تنفسی سین‌سیشیال در ماه‌های سرد زمستان و بهار در ایالات متحده رخ می‌دهد. در حالی که همه‌گیری ویروس تنفسی سین‌سیشیال با ماه‌های گرم‌تر در سنگاپور به طور قابل توجهی همبستگی دارد.[2] پیشنهاد شده است که خشکی سطوح مخاطی احتمال گسترش باکتریایی را افزایش می‌دهد. باران مخاط را مرطوب می‌کند، بنابراین گسترش ارگانیسم را از طریق گرد و غبار کاهش می‌دهد.[9] هوای خشک و تغییرات دما ممکن است عملکرد مژک‌دار را تغییر دهد. توضیح اخیر در مورد تغییرات فصلی در بروز عفونت‌های تنفسی نشان می‌دهد که این تغییرات به دلیل اثرات آلاینده‌های جوی بر عملکرد مژک‌دار میزبان است.[10] با این حال، تغییر عوامل محیطی بر حساسیت میزبان به عفونت تأثیر می‌گذارد، یا به دلیل تغییرات فصلی در عملکرد ایمنی میزبان (ایمنی هومورال و سلولی) یا به دلیل اثرات مستقیم محیطی.[9] مکانیسم‌های تأثیر فصلی بر سیستم ایمنی میزبان متفاوت است، همانطور که از داده‌های آزمایش‌هایی که بر روی حیوانات و انسان‌ها انجام شده است، مشخص است. مطالعات تجربی اخیر بر روی جوندگان، پرندگان و انسان‌ها نشان می‌دهد که سیستم ایمنی در زمستان تضعیف می‌شود.[11] مطالعه دیگری بر روی هامسترهای سیبریایی نشان داد که فعالیت سلول‌های کشنده طبیعی و تکثیر لنفوسیت‌ها افزایش یافته و فعالیت فاگوسیتوز و انفجار اکسیداتیو توسط گرانولوسیت‌ها در روزهای تابستان کاهش می‌یابد.[9] همانطور که در جوندگان مشاهده شد، تغییرات فصلی تغییرات قابل توجهی در پاسخ‌های میتوژنیک لنفوسیت‌ها و در مقدار لنفوسیت‌های در گردش، نوتروفیل‌ها، سلول‌های CD4 و CD8 و IL-6 ایجاد کرد.[9] برخی از مقادیر، مانند فعالیت آریل هیدروکربن هیدروکسیلاز لنفوسیت، در تابستان به اوج می‌رسند.[12]، در حالی که برخی دیگر، مانند تعداد سلول‌های CD4+T، CD25+T، CD20+B و نسبت CD4+/CD8+ در زمستان به اوج می‌رسند و در تابستان کمترین میزان را دارند. علاوه بر این، تنظیم نزولی تولید IL-1β، IL-6، TNF-α، اینترفرون (IFN)-γ و IL-10 وابسته به TLR-4 در تابستان در مقایسه با زمستان مشاهده شد.[13] علاوه بر این، مطالعات کمی تغییرات فصلی در سایر مقادیر ایمونولوژیکی را در طول فصول سال مشاهده کرده‌اند. به عنوان مثال، تغییرات قابل توجهی در تعداد کل گلبول‌های سفید خون، با اوج در زمستان (حداکثر حدود دسامبر-مارس) و کمترین میزان در تابستان (مه-آگوست) و تغییرات فصلی در تعداد لنفوسیت‌های T و B در گردش مشاهده شد. به عنوان مثال، تعداد سلول‌های T در اواخر پاییز به اوج می‌رسد، در حالی که سلول‌های B در زمستان به اوج می‌رسند.[14] در یک مطالعه بر روی کودکان آفریقایی غربی سالم، درصد لنفوسیت‌ها، تعداد مطلق لنفوسیت‌ها، تعداد مطلق سلول‌های CD4+ T-lymphocyte و نسبت CD4+/CD8+ در طول فصل بارانی (ژوئن-اکتبر) در مقایسه با فصل خشک (نوامبر-مه) به طور قابل توجهی کمتر بود، در حالی که درصد CD8+ در فصل بارانی بیشتر از فصل خشک بود.[15] در مطالعه دیگری، چهار فرد سالم به مدت 7 سال پیگیری شدند، تعداد مطلق سلول‌های CD4+ T lymphocyte در تابستان زمانی که سلول‌های CD8+ T-lymphocyte بالاترین میزان را داشتند، کمترین میزان را داشت. تغییرات فصلی قابل توجهی در تعداد کل گلبول‌های سفید یا تعداد کل لنفوسیت‌ها وجود نداشت.[16] به طور مشابه، تعداد کل لکوسیت‌ها و لنفوسیت‌ها در مطالعه دیگری بر روی شش فرد سالم در طول یک سال تغییرات فصلی را نشان نداد، در حالی که درصد سلول‌های B در سردترین ماه تقریباً دو برابر سطحی بود که در تابستان مشاهده شد.[16] طبق مطالعه اخیر، سطح پایین‌تر تعداد متوسط سلول‌های CD4+T و نسبت متوسط CD4+/CD8+ در مردان مبتلا به HIV در تابستان و بهار یافت شد.[17] مکانیسم زیربنایی تغییرات سالانه در عملکرد ایمنی با فعالیت هورمون‌های آدرنوکورتیکال مرتبط است. هورمون‌های آدرنوکورتیکال به صورت سالانه با افزایش سطح ترشح در زمستان و کاهش در تابستان تغییر می‌کنند. یکی از پیامدهای این تغییر، الگوی سالانه در عملکرد ایمنی است. کورتیکواستروئیدهای آدرنال، به ویژه گلوکوکورتیکواستروئیدها، عملکرد ایمنی سلولی را سرکوب می‌کنند و نشان داده شده است که در برابر سلول‌های سرکوبگر T موثرتر هستند. بنابراین، هنگامی که فعالیت آدرنوکورتیکال افزایش می‌یابد، فعالیت سلول‌های T سرکوب می‌شود و فعالیت سلول‌های B افزایش می‌یابد. در مقابل، نوسانات شبانه‌روزی در پارامترهای ایمنی به نظر می‌رسد مستقل از ترشح گلوکوکورتیکوئید باشد.[18]
برای تعیین اینکه آیا تغییرات فصلی در فعالیت ایمنی به دما وابسته است یا خیر، یک مطالعه بر روی هشت مرد سالم نشان داد که فعالیت سلول‌های NK پس از قرار گرفتن در معرض هوای سرد حاد افزایش می‌یابد.[19] مطالعه دیگری نشان داد که غوطه‌وری حاد در آب سرد (14 درجه سانتیگراد) سه بار در هفته به مدت 6 هفته باعث افزایش قابل توجهی در نسبت مونوسیت‌ها، لنفوسیت‌ها و درصد سلول‌های CD14+ و CD25+ می‌شود.[20] در مقابل، دمای پایین تأثیری بر نسبت سلول‌های B نشان نداد.[21] بنابراین، درجه تأثیر سرما بر عملکرد ایمنی همچنان مورد بحث است.
فصلی بودن ویتامین D
ارتباط بین کمبود ویتامین D و حساسیت به عفونت بیش از یک قرن است که پیشنهاد شده است. اخیراً، مطالعات اپیدمیولوژیک ارتباطات قوی بین تغییرات فصلی در سطوح ویتامین D و بروز بیماری‌های عفونی مختلف نشان داده‌اند.[22] تغییرات فصلی قابل توجهی در سطح ویتامین D در چندین جامعه مشاهده شده است، که نشان دهنده تغییر در مقادیر 25-(OH) D است، که در تابستان و بهار افزایش می‌یابد و به تدریج در پاییز و زمستان کاهش می‌یابد.[1] یک مطالعه انجام شده در بوستون (42 درجه شمالی) نشان داد که نرخ تبدیل پروویتامین D3 به پروویتامین D3 در ژوئن و جولای به حداکثر می‌رسد و سپس به تدریج در آگوست و اکتبر کاهش می‌یابد. تولید پروویتامین D3 از نوامبر تا مارس تشخیص داده نشد. مطالعه مشابهی در ادمونتون، کانادا (52 درجه شمالی) نشان داد که تبدیل پروویتامین D3 پس از اواسط اکتبر متوقف شد و تا اواسط آوریل بازنگشت.[23] در یک مطالعه بر روی افراد سالم ساکن بالتیمور با سن 20 تا 94 سال، افزایش سطح 25-OH D از حداقل در آوریل-مه 72.9 نانومول در لیتر به اوج در اکتبر 95.8 نانومول در لیتر مشاهده شد.[24] مطالعات انجام شده در بسیاری از نقاط جهان وجود تغییرات فصلی قابل توجهی در ویتامین D را تأیید کرده است.[25] شواهد اپیدمیولوژیک نشان می‌دهد که تغییرپذیری فصلی به دلیل این است که بیشتر مردم در زمستان بیشتر در داخل خانه هستند و لباس‌های بیشتری می‌پوشند، در نتیجه سطح کمتری از پوست را در معرض نور خورشید قرار می‌دهند. علاوه بر این، میزان نور UV که به هر فرد روی زمین می‌رسد با فصل و عرض جغرافیایی متفاوت است، به ویژه در زمستان.
فصلی بودن ملاتونین
ملاتونین یک هورمون طبیعی قدرتمند است که به خوبی به دلیل ارتباط آن با ریتم‌های شبانه‌روزی و فصلی شناخته شده است و سنتز آن توسط چرخه نور/تاریکی محیطی تنظیم می‌شود. ملاتونین در عملکردهای مختلف بدن شرکت می‌کند، از جمله نقش تعدیل‌کننده ایمنی آن در سال‌های اخیر اهمیت قابل توجهی پیدا کرده است. گزارش شده است که ملاتونین در مبارزه با عفونت‌های باکتریایی و ویروسی موثر است. نشان داده شده است که ملاتونین در تنظیم ایمنی سلولی و هومورال نقش دارد. ملاتونین نه تنها تولید سلول‌های کشنده طبیعی، مونوسیت‌ها و لکوسیت‌ها را تحریک می‌کند، بلکه تعادل سلول‌های T helper (Th)-1 و Th-2 را عمدتاً به سمت پاسخ‌های Th-1 تغییر می‌دهد و تولید سیتوکین‌های مرتبط مانند اینترلوکین (IL)-2، IL-6، IL-12 و اینترفرون-γ را افزایش می‌دهد.[26] تغییرات فصلی در عملکرد ایمنی مشاهده شده در حیوانات و انسان‌ها احتمالاً توسط تغییرات در مدت زمان ترشح ملاتونین واسطه می‌شود. این واقعیت ممکن است تا حدی در الگوی چرخه‌ای بیان علائم برخی از بیماری‌های عفونی نقش داشته باشد که در زمان‌های خاصی از سال بیشتر مشهود می‌شوند.
نتیجه‌گیری
تغییرپذیری فصلی در بروز بیماری‌های عفونی احتمالاً تحت تأثیر حساسیت و رفتارهای جمعیت قرار دارد، با این حال، عوامل محیطی نیز ملاحظات مهمی هستند. چنین عوامل محیطی می‌توانند بر فراوانی عوامل بیماری‌زا تأثیر بگذارند. دانش نقش عوامل محیطی (عفونت، سرما و غیره) یا سایر محرک‌ها (فعالیت داخل خانه، مصرف ویتامین D) می‌تواند برای بهبود اقدامات پیشگیرانه و استراتژی‌های آموزشی، به ویژه در افراد در معرض خطر ابتلا به عفونت استفاده شود. باید به مردم در مورد اهمیت تهویه مناسب مسکن و مزایای بالقوه افزایش فعالیت در فضای باز در نور UV طبیعی اطلاع داده شود. علاوه بر این، ممکن است وضعیت کافی ویتامین D به ویژه در زمستان برای کاهش میزان عفونت مورد نیاز باشد. مطالعات جمعیت‌محور آینده برای ارزیابی اثرات گسترده مکمل ویتامین D بر میزان عفونت ممکن است توجیه پذیر باشد.

یادداشت‌ها
منبع حمایت: ندارد
تضاد منافع: اعلام نشده
مراجع
3. Hechler T, Chau JY, Giesecke S, Vocks S. Perception of seasonal changes in physical activity among young Australian and German women. Med J Aust. 2004;181:710–1. [PubMed] [Google Scholar]
4. Chan CB, Ryan DA, Tudor-Locke C. Relationship between objective measures of physical activity and weather: A longitudinal study. Int J Behav Nutr Phys Act. 2006;3:21. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
5. Güler T, Sivas F, Başkan BM, Günesen O, Alemdaroğlu E, Ozoran K. The effect of outfitting style on bone mineral density. Rheumatol Int. 2007;27:723–7. [PubMed] [Google Scholar]
6. Sinclair R, Boone SA, Greenberg D, Keim P, Gerba CP. Persistence of category A select agents in the environment. Appl Environ Microbiol. 2008;74:555–63. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
7. Fisman DN. Seasonality of infectious diseases. Annu Rev Public Health. 2007;28:127–43. [PubMed] [Google Scholar]
8. Kremer L, Guérardel Y, Gurcha SS, Locht C, Besra GS. Temperature-inducedchanges in the cell-wallcomponents of Mycobacterium thermoresistibile. Microbiology. 2002;148:3145–54. [PubMed] [Google Scholar]
9. Dowell SF. Seasonal variation in host susceptibility and cycles of certain infectious diseases. Emerg Infect Dis. 2001;7:369–74. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
10. Agius AM, Smallman LA, Pahor AL. Age, smoking and nasalciliary beat frequency. Clin Otolaryngol Allied Sci. 1998;23:227–30. [PubMed] [Google Scholar]
11. Altizer S, Dobson A, Hosseini P, Hudson P, Pascual M, Rohani P. Seasonality and the dynamics of infectious diseases. Ecol Lett. 2006;9:467–84. [PubMed] [Google Scholar]
12. Paigen B, Ward E, Reilly A, Houten L, Gurtoo HL, Minowada J. Seasonal variation of aryl hydrocarbon hydroxylase activity in human lymphocytes. Cancer Res. 1981;41:2757–61. [PubMed] [Google Scholar]
13. Khoo AL, Chai LY, Koenen HJ, Sweep FC, Joosten I, Netea MG, et al. Regulation of cytokine responses by seasonality of vitamin D status in healthy individuals. Clin Exp Immunol. 2011;164:72–9. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
14. Maes M, Stevens W, Scharpé S, Bosmans E, De Meyer F, D’Hondt P. Seasonal variation in peripheral blood leukocyte subsets and in serum interleukin-6, and soluble interleukin-2 and -6 receptor concentrations in normal volunteers. Experientia. 1994;50:821–9. [PubMed] [Google Scholar]
15. Lisse IM, Aaby P, Whittle H, Jensen H, Engelmann M, Christensen LB. T-lymphocyte subsets in West African children: Impact of age, sex, and season. J Pediatr. 1997;130:77–85. [PubMed] [Google Scholar]
16. Paglieroni TG, Holland PV. Circannual variation in lymphocyte subsets, revisited. Transfusion. 1994;34:512–6. [PubMed] [Google Scholar]
17. Termorshuizen F, Geskus RB, Roos MT, Coutinho RA, Van Loveren H. Seasonal influences on immunological parameters in HIV-infected homosexual men: Searching for the immunomodulating effects of sunlight. Int J Hyg Environ Health. 2002;205:379–84. [PubMed] [Google Scholar]
18. Skwarło-Sońta K. Functional connections between the pineal gland and immune system. Acta Neurobiol Exp (Wars) 1996;56:341–57. [PubMed] [Google Scholar]
19. Lackovic V, Borecký L, Vigas M, Rovenský J. Activation of NK cells in subjects exposed to mild hyper- or hypothermic load. J Interferon Res. 1988;8:393–402. [PubMed] [Google Scholar]
20. Castellani JW, M Brenner IK, Rhind SG. Cold exposure: Human immune responses and intracellular cytokine expression. Med Sci Sports Exerc. 2002;34:2013–20. [PubMed] [Google Scholar]
21. Bratescu A, Teodorescu M. Circannual variations in the B cell/T cell ratio in normal human peripheral blood. J Allergy Clin Immunol. 1981;68:273–80. [PubMed] [Google Scholar]
22. Yamshchikov AV, Desai NS, Blumberg HM, Ziegler TR, Tangpricha V. Vitamin D for treatment and prevention of infectious diseases: A systematic review of randomized controlled trials. Endocr Pract. 2009;15:438–49. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
23. Webb AR, Kline L, Holick MF. Influence of season and latitude on the cutaneous synthesis of vitamin D: Exposure to winter sunlight in Boston and Edmonton will not promote vitamin D synthesis inhuman skin. J Clin Endocrinol Metab. 1988;67:373–8. [PubMed] [Google Scholar]
24. Sherman SS, Hollis BW, Tobin JD. Vitamin D status and related parameters in a healthy population: The effects of age, sex and season. J Clin Endocrinol Metab. 1990;71:405–13. [PubMed] [Google Scholar]
25. Romero-Ortuno R, Cogan L, Browne J, Healy M, Casey MC, Cunningham C, et al. Seasonal variation of serum vitamin D and the effect of vitamin D supplementation in Irish community-dwelling older people. Age Ageing. 2011;40:168–74. [PubMed] [Google Scholar]
26. Srinivasan V, Spence DW, Trakht I, Pandi-Perumal SR, Cardinali DP, Maestroni GJ. Immunomodulation by melatonin: Its significance for seasonally occurring diseases. Neuroimmunomodulation. 2008;15:93–101. [PubMed] [Google Scholar]

مقالات مجله بین‌المللی پزشکی پیشگیرانه با مجوز Wolters Kluwer - انتشارات Medknow ارائه شده‌اند.