فهرست مجلات
مجله زیست‌شناسی ترکی
جلد 44(2)؛ 2020
PMC7129066

چکیده
فناوری‌های ویرایش ژنوم، تحولات اساسی در علم ژنتیک ایجاد کرده‌اند. در میان آن‌ها، فناوری CRISPR-Cas9 به دلیل مزایایی مانند سهولت کاربری، دقت بالا و هزینه پایین، برجسته است. این فناوری به سرعت در زمینه‌های مرتبط با انسان، حیوانات و محیط زیست معرفی شده است، در حالی که سوالات دشوار، کاربردها، نگرانی‌ها و مسائل اخلاقی زیستی را برای بحث و بررسی مطرح می‌کند. بیشتر نگرانی‌ها ناشی از استفاده از CRISPR-Cas9 برای تغییر ژنتیکی سلول‌های زایشی و جنین‌های انسان (که به عنوان ویرایش ژنوم زایشی شناخته می‌شود) است. ویرایش ژنوم زایشی منجر به مسائل اخلاقی زیستی متعددی می‌شود، مانند بروز تغییرات ناخواسته در ژنوم، نحوه و از چه کسی رضایت آگاهانه اخذ می‌شود و اصلاح نژاد انسان (نژادپرستی). با این حال، نباید مسائل اخلاقی زیستی که فناوری CRISPR-Cas9 می‌تواند در محیط زیست، کشاورزی و دامپروری ایجاد کند را نیز نادیده گرفت. برای استفاده ایمن از CRISPR-Cas9 در همه زمینه‌ها و حل مسائل احتمالی، باید قوانین جهانی با در نظر گرفتن نظرات دانشمندان علوم زیستی و اجتماعی، سیاست‌گذاران و سایر ذینفعان بخش‌ها تهیه شود و کاربردهای CRISPR-Cas9 باید طبق این قوانین اجرا شود. با این حال، این کنترل‌ها نباید آزادی علمی را محدود کنند. در اینجا، کاربردهای مختلف فناوری CRISPR-Cas9، به ویژه در پزشکی و کشاورزی، شرح داده شده و مسائل اخلاقی مربوط به ویرایش ژنوم با استفاده از فناوری CRISPR-Cas9 مورد بحث قرار گرفته است. نگرانی‌های اجتماعی و اخلاقی زیستی مربوط به انسان‌ها، سایر موجودات و محیط زیست مورد بررسی قرار گرفته است.
کلمات کلیدی: ویرایش ژنوم، فناوری CRISPR-Cas9، مسائل اخلاقی زیستی، اخلاق زیستی
1. مقدمه
برای سال‌های متمادی، زیست‌شناسان مولکولی به دنبال راه‌هایی برای استفاده از مکانیسم‌های ترمیم سلولی برای دستکاری DNA از طریق ویرایش ژنوم بوده‌اند. به این ترتیب، آن‌ها قدرت تغییر ژنوم را با اصلاح یک جهش یا معرفی یک عملکرد جدید (Rodriguez, 2016) به دست می‌آوردند. برای این منظور، فناوری‌های ویرایش ژنوم توسعه یافتند (Memi et al., 2018). در سال‌های اخیر، فناوری تکرارهای کوتاه پالیندرومیک منظم خوشه‌ای (CRISPR-Cas9) به پرکاربردترین روش ویرایش ژن تبدیل شده است. این فناوری دارای مزایایی مانند دقت بالا، سهولت کاربری و هزینه نسبتاً پایین در مقایسه با فناوری‌های قبلی مانند نوکلئاز انگشتی روی (ZFN) و نوکلئاز فعال‌کننده رونویسی شبیه به اثرگذار (TALEN) است. به لطف این مزایا، فناوری CRISPR-Cas9 می‌تواند به راحتی در هر آزمایشگاه زیست‌شناسی مولکولی مورد استفاده قرار گیرد.
فناوری‌های ویرایش ژنوم در ایجاد مدل‌های بیماری انسانی در حیوانات آزمایشگاهی و برای درک عملکردهای اساسی ژن استفاده می‌شوند. آن‌ها همچنین پتانسیل درمانی بالایی برای درمان بیماری‌های درمان‌نشده مانند برخی از سرطان‌ها، اختلالات ژنتیکی و HIV/AIDS دارند. امروزه، ویرایش ژنوم در سلول‌های سوماتیک یکی از حوزه‌های امیدوارکننده توسعه درمانی است (Otieno, 2015). با این حال، مسائل اخلاقی زیستی مختلفی به دلیل تأثیر بالقوه این فناوری‌ها بر ایمنی ذخایر غذایی و کاربردهای بالینی (Hundleby and Harwood, 2018; Hirch et al., 2019) ایجاد شده است. این بررسی به تفصیل به چالش‌ها، پیامدهای احتمالی و مسائل اخلاقی زیستی CRISPR-Cas9 می‌پردازد.
2. زیست‌شناسی و عملکرد فناوری CRISPR-Cas9
فناوری‌های ویرایش ژنوم اغلب با ایجاد شکستگی در DNA کروموزومی کار می‌کنند. ZFN، TALEN و CRISPR-Cas9 همگی بر اساس نوکلئازها هستند (Kim and Kim, 2014; Roh et al., 2018). قدرت این فناوری‌ها از توانایی ایجاد شکستگی در ناحیه مورد نظر توالی هدف تعیین شده توسط محقق ناشی می‌شود. این امر به محققان اجازه می‌دهد تا ژنوم را در هر ناحیه به صورت عملی اصلاح کنند (Memi et al., 2018).
ایجاد تغییرات در ژنوم عمدتاً به ظرفیت ترمیم DNA سلول‌ها بستگی دارد (Lau et al., 2018). همه سلول‌ها دارای دو مکانیسم اساسی برای ترمیم شکستگی‌های زنجیره دوتایی در DNA هستند. یکی از آن‌ها اتصال غیرهمولوگ انتهایی (NHEJ) و دیگری مکانیسم ترمیم وابسته به همولوگ (HDR) است. در NHEJ، انتهای شکستگی‌ها به سرعت مستقیماً به یکدیگر متصل می‌شوند، صرف نظر از همولوژی توالی، در حالی که HDR برای ترمیم محل آسیب‌دیده DNA به همولوژی نیاز دارد. برای دستیابی به همولوژی، کروماتید خواهر سالم به عنوان الگو استفاده می‌شود و آسیب DNA ترمیم می‌شود (Urnov, 2018).
CRISPR-Cas9 یک سیستم دفاعی طبیعی در پروکاریوت‌ها است که مقاومت در برابر عناصر ژنتیکی خارجی مانند پلاسمیدها و باکتریوفاژها را فراهم می‌کند (Barrangau et al., 2007; Marraffini and Sontheimer, 2008). هنگامی که ویروس یا پلاسمید وارد سلول باکتریایی می‌شود، CRISPR-Cas9 اجازه می‌دهد تا مولکول‌های کوتاه DNA ویروسی به محل CRISPR اضافه شوند. توالی‌های CRISPR (CRISPRs) تکرارهای کوتاهی از DNA ویروسی یا پلاسمیدی هستند که در ژنوم باکتری‌ها یافت می‌شوند و به عنوان تکرارهای کوتاه پالیندرومیک منظم خوشه‌ای تعریف می‌شوند. ژن‌های Cas (مرتبط با CRISPR) ژن‌هایی هستند که پروتئین‌های نوکلئاز یا هلیکاز مرتبط با توالی‌های تکرار CRISPR را رمزگذاری می‌کنند که عملکرد برش یا انحلال DNA را دارند (Jansen et al., 2002). Cas9، عضوی از خانواده ژن Cas، از استرپتوکوکوس پیوژنز جدا شده است و یک اندونوکلئاز است که قادر به برش DNA از دو ناحیه برش فعال در هر دو انتهای مارپیچ دوتایی DNA است (Doudna and Charpentier, 2014; Rodriguez, 2016). سیستم CRISPR-Cas DNA ویروس یا باکتری مهاجم را تشخیص می‌دهد و پروتئین Cas را برای از بین بردن DNA خارجی هدایت می‌کند (Otieno, 2015).
در سال‌های بعد، کشف شد که سیستم CRISPR-Cas می‌تواند برای یافتن و برش نواحی خاص DNA هدف برنامه‌ریزی شود و در نتیجه ویرایش ژنوم را فراهم کند (Jinek et al., 2012; Hsu et al., 2013). با درک اینکه ژنوم انسان می‌تواند توسط CRISPR-Cas9 ویرایش شود، مشخص شد که ویرایش ژنوم می‌تواند برای اهداف درمانی نیز مورد استفاده قرار گیرد و عصر جدیدی در مهندسی ژنتیک آغاز شد (Lau et al., 2018; Roh et al., 2018).
3. حوزه‌های کاربرد
3.1. مدل‌های حیوانی
CRISPR-Cas9 می‌تواند برای ایجاد مدل‌های حیوانی برای تقلید از بیماری‌های انسانی و درک توسعه بیماری با جهش یا خاموش کردن ژن‌ها استفاده شود. یک مدل موشی برای تعیین اثرات مضر جهش‌ها در سرطان با ایجاد جهش‌هایی که باعث از دست دادن عملکرد در ژن‌های سرکوبگر تومور یا دادن عملکرد به پروتو-انکونژن‌ها می‌شوند، ایجاد شده است (Chin, 2015).
مدل‌های موشی ژنتیکی معمولی (GM) با هدف‌گیری ژن در سلول‌های بنیادی جنینی یا ترانس‌ژنز تولید می‌شوند که زمان‌بر و پرهزینه هستند. با CRISPR-Cas9، موش‌های GM می‌توانند در مدت زمان بسیار کوتاه‌تری به طور موثر تولید شوند (Mei et al., 2016). این فناوری می‌تواند به نخستی‌های غیرانسانی مانند میمون‌ها نیز اعمال شود. نخستی‌های غیرانسانی از نظر تشریحی، فیزیولوژیکی و ژنتیکی به انسان‌ها شبیه‌تر از جوندگان هستند (Zhang et al., 2014). بنابراین، آن‌ها مدل‌های مناسب‌تری نسبت به جوندگان برای درک بیولوژی و توسعه بیماری انسان هستند (Xin et al., 2016). اولین کاربرد موفق CRISPR-Cas9 در نخستی‌های غیرانسانی، که یک میمون ناک‌اوت تولید شد، در سال 2014 محقق شد (Niu et al., 2014). با این حال، توالی‌های ژنوم بسیاری از نخستی‌های غیرانسانی هنوز به طور کامل شناسایی نشده‌اند. این امر طراحی RNAهای راهنمای واحد (sgRNAs) انتخابی را دشوار می‌کند (Gou and Li, 2015; Lou et al., 2016). بنابراین، کاربرد CRISPR-Cas9 در نخستی‌های غیرانسانی هنوز در مراحل اولیه است.
3.2. ویرایش ژنوم در بافت‌های خاص
محققان توانسته‌اند با استفاده از تزریق هیدرودینامیکی و ویروس مرتبط آدنو (AAV)، ژنوم بافت‌های خاص مانند بافت کبد و مغز را اصلاح کنند (Rodriguez et al., 2014; Senis et al., 2014). در یک مطالعه، CRISPR-Cas9 با موفقیت و به طور موثر در سیستم عصبی پستانداران اعمال شد. مخلوطی از پروتئین سبز فلورسنت (GFP) برچسب‌گذاری شده AAV-spCas9 و پلاسمیدهای AAV-spGuide به صورت in vivo به چین‌های دندانه دار هیپوکامپ مغز موش‌های نر بالغ منتقل شد (Swiech et al., 2015). پیش‌بینی می‌شود که تعداد این کاربردها در زمینه‌های سرطان و علوم اعصاب در سال‌های آینده افزایش یابد (Mei et al., 2016).
3.3. جهش‌های چندگانه ژنی
CRISPR-Cas9 می‌تواند برای تولید جهش‌یافته برای ژن‌های هدف استفاده شود. در اولین مطالعه توسط Li et al.، شش sgRNA هدف قرار دهنده mRNA Cas9 و شش ناحیه ژنومی مختلف رمزگذاری کننده ژن‌های Tet1، Tet2 و Tet3 به سیتوپلاسم جنین‌های موش منتقل شدند (Li et al., 2013). یافته‌ها نشان داد که در 59 درصد توله‌های موش نوزاد، هر سه ژن Tet دارای جهش‌های مورد نظر بودند. نتایج مثبتی در مطالعات با جنین‌های ماهی گورخر و Arabidopsis نیز گزارش شد (Ota et al., 2014; Wang et al., 2015).
3.4. مطالعات اپی‌ژنوم
مطالعات اپی‌ژنوم می‌توانند به دو روش مختلف انجام شوند: ویرایش ژنوم یا ویرایش اپی‌ژنوم (Chen et al., 2014; Huisman et al., 2015). در ویرایش ژنوم، از نوکلئاز برای اصلاح توالی DNA استفاده می‌شود، در حالی که در ویرایش اپی‌ژنوم، از یک دامنه اثرگذار استفاده می‌شود و توالی DNA تغییر نمی‌کند. این عملکرد با غیرفعال کردن کاتالیزوری دامنه اثرگذار مرتبط با پروتئین Cas9 با جایگزینی پروتئین Cas9 به دست می‌آید. پروتئین‌های اثرگذار تغییر یافته برای فعال یا سرکوب رونویسی استفاده می‌شوند (Lau and Davie, 2016). در ویرایش اپی‌ژنوم، می‌توان اپی‌ژنوم را با تغییر پروتئین‌هایی که اپی‌ژنوم را حفظ و محافظت می‌کنند، اصلاح کرد. سرکوب متیلاسیون DNA در نتیجه تخریب دامنه‌های کاتالیزوری که تسریع از دست دادن متیلاسیون DNA کروی را در سلول‌های انسانی ایجاد می‌کنند، نمونه خوبی از مطالعات اپی‌ژنوم با استفاده از CRISPR-Cas9 است (Liao et al., 2015).
کاربرد دیگر ویرایش RNAهای غیرکدشونده طولانی (lncRNAs) و RNAهای تقویت‌کننده (eRNAs) است که می‌توانند بیان ژن و فرآیندهای اپی‌ژنوم را کنترل کنند. در یک مطالعه، عوامل بیان eRNA و تقویت‌کننده‌های بیان lncRNA با القای جهش‌های حذف در یک رده سلولی لنفوم با استفاده از CRISPR-Cas9 سرکوب شدند (Pefanis et al., 2015). پیش‌بینی می‌شود که CRISPR-Cas9 امکان تغییرات اپی‌ژنوم در سطوح مختلف را فراهم کند و تغییرات بیشتری را در انسان تسهیل کند (Liao et al., 2015; Mei et al., 2016).
3.5. درمان بیماری‌ها
CRISPR-Cas9 می‌تواند به سلول‌ها به صورت in vivo یا ex vivo اعمال شود. در رویکرد in vivo، CRISPR-Cas9 مستقیماً به سلول‌ها در بدن با استفاده از روش‌های ویروسی یا غیرویروسی منتقل می‌شود. در رویکرد ex vivo، ابتدا سلول‌ها از بدن خارج می‌شوند. سپس CRISPR به سلول‌ها اعمال می‌شود و آن‌ها به بدن بازگردانده می‌شوند (Roh et al., 2018). این رویکرد پتانسیل بالایی برای توسعه درمان‌های مبتنی بر بافت دارد (Rath et al., 2015). با استفاده از CRISPR-Cas9، جهش در پروتئین دیستروفین مسئول شایع‌ترین شکل دیستروفی عضلانی دوشن به طور موفقیت‌آمیز حذف شد (Amoasii et al., 2018; Duchêne et al., 2018; Koo et al., 2018; Long et al., 2018). مطالعاتی برای پیشگیری و درمان AIDS با مهار ورود HIV به سلول یا حذف ژنوم HIV یکپارچه شده در ژنوم میزبان با استفاده از CRISPR-Cas9 وجود دارد (Saayman et al., 2015). سلول‌های بنیادی القایی چندتوانه (iPSCs) با موفقیت از بیماران مبتلا به فیبروز کیستیک با حذف تایید شده F508 در ژن تنظیم‌کننده فیبروز کیستیک (CFTR) تولید شدند (Firth et al., 2015). مطالعاتی نیز برای آب مروارید (Wu et al., 2015; Yang et al., 2016) و بیماری پارکینسون (Yang et al., 2016) وجود دارد. با این حال، مطالعات اخیر نشان داده‌اند که CRISPR-Cas9 مسیر اینترفرون نوع 1 (INF) را فعال می‌کند و باعث پاسخ ایمنی واسطه INF نوع 1 می‌شود (Kim et al., 2018; Charlesworth et al., 2019). این یافته‌ها در حال حاضر استفاده از CRISPR-Cas9 را در درمان محدود می‌کنند.
3.6. کاربردهای صنعتی
CRISPR برای اولین بار برای اهداف تجاری برای ایجاد کشت‌های باکتریایی مقاوم به عفونت‌های ویروسی مورد استفاده در تولید پنیر و ماست استفاده شد (van Erp et al., 2015). یکی از کاربردها در کشاورزی، تولید محصولات GM است (Hundleby and Harwood, 2019). تلاش‌هایی برای افزایش عملکرد در صنعت دامپروری وجود دارد (van Erp et al., 2015). می‌توان از آن برای کنترل گونه‌های آفت مهاجم برای معکوس کردن مقاومت به آفت‌کش‌ها و علف‌کش‌ها در حشرات و علف‌های هرز یا جلوگیری از گسترش بیماری استفاده کرد (Esvelt et al., 2014). محققان موفق شده‌اند از گسترش ژن‌های محافظت کننده از پشه‌ها در برابر انگل‌های مالاریا جلوگیری کنند (Gantz et al., 2015) و پشه‌های ماده را در آزمایشگاه عقیم کنند (Hammond et al., 2016). توسعه واکسن یکی دیگر از حوزه‌های مورد علاقه قابل توجه است. بردار ویروس آبله (VACV) در ریشه‌کنی و واکسیناسیون آبله استفاده می‌شود. با استفاده از CRISPR-Cas9، کارایی بردار VACV بدون نشانگر افزایش یافته است (Yuan et al., 2015). مثال دیگر، واکسن هپاتیت B است. برای جلوگیری از بیان و تکثیر ویروس، نواحی خاصی از ژنوم هپاتیت B هدف قرار گرفته و توسط CRISPR-Cas9 برش داده شدند (Ramanan et al., 2015).
3.7. ویرایش RNA
توالی‌های RNA تک‌رشته‌ای (ssRNA) نیز می‌توانند توسط CRISPR-Cas9 ویرایش شوند. در ویرایش RNA، CRISPR-Cas9 از یک الیگونوکلئوتید DNA تشکیل شده است که ناحیه PAM (motif مجاور پروتئاز) (PAMmer)، ssRNA، RNA راهنما (gRNA) و پروتئین Cas9 را ارائه می‌دهد. PAMmer به عنوان یک ناحیه PAM عمل می‌کند که به طور خاص توسط Cas9 شناسایی می‌شود و Cas9 را برای اتصال و برش ssRNA هدف هدایت می‌کند. اتصال خاص ssRNAهای هدف به PAMmerهای کشیده 5' که حاوی بازهای جفت شده با ssRNAهای مختلف و بلافاصله در مقابل PAM هستند، مورد نیاز است. از آنجایی که مولکول‌های RNA عملکردهای متفاوتی نسبت به DNA دارند، CRISPR-Cas9 می‌تواند کاربرد انعطاف‌پذیرتری نسبت به سایر روش‌های ویرایش ژنوم ارائه دهد (Mei et al., 2016).
3.8. کاربردهای نظامی
یکی از حوزه‌های کاربرد کمتر مورد بحث فناوری CRISPR-Cas9، استفاده از آن برای اهداف نظامی است. همانطور که می‌دانید، بخش قابل توجهی از مطالعات ویرایش ژنوم توسط وزارتخانه‌های دفاع کشورها حمایت مالی می‌شود. این مطالعات معمولاً بر افزایش تحمل سربازان در برابر جنگ‌افزارهای بیولوژیکی یا شیمیایی متمرکز است. این فناوری پتانسیل تأثیرگذاری بر بهینه‌سازی عملکرد انسان را دارد (Greene and Master, 2018). مطالعات معمولاً بر کشف ژن‌های مختلفی متمرکز است که می‌توان آن‌ها را از گونه‌های دیگر به دست آورد (Gracheva et al., 2010) و شناسایی ژن‌های جدیدی که می‌توانند با اختلال استرس پس از سانحه مرتبط باشند که اغلب توسط سربازان تجربه می‌شود (Cornelis et al., 2010). در یک مطالعه توسط Zou et al. (2015)، محققان جنین‌های سگ با توده عضلانی بالاتر با استفاده از CRISPR-Cas9 ایجاد کردند. مطالعه دیگری نشان داد که ژن CMG2 که باعث حساسیت کم به سم آنتراکس در صورت بیان در مقادیر کم می‌شود، می‌تواند با این فناوری خاموش شود (Arévalo et al., 2014). با این حال، باید توجه داشت که تحقیقات بیشتری برای استفاده از فناوری CRISPR در انسان به عنوان یک ابزار دفاعی در برابر سلاح‌های بیولوژیکی و شیمیایی مورد نیاز است (Greene and Master, 2018).
3.9. جایگزینی DNA در جنین‌های انسان (درمان ژنوم زایشی)
بحث‌برانگیزترین کاربرد CRISPR-Cas9، اصلاح DNA جنین انسان یا به عبارت دیگر، استفاده از آن برای درمان ژنوم زایشی است. در سال 2015، گروهی از محققان چینی به رهبری Junjiu Huang از CRISPR-Cas9 برای حذف یک جهش که باعث تالاسمی بتا، یک بیماری خونی کشنده می‌شود، از ژن بتا-گلوبین (HBB) در ژنوم جنین‌های انسان استفاده کردند. در این تحقیق، از شش جنین غیرطبیعی که برای لقاح آزمایشگاهی مناسب نبودند، استفاده شد. جهش فقط در یک جنین قابل اصلاح بود. اگرچه جهش در دو جنین دیگر قابل اصلاح بود، اما اثرات غیرهدف در ژن‌های دیگر رخ داد. در سه جنین دیگر، جهش قابل اصلاح نبود. گزارش شده است که به دلیل اثرات غیرهدف در ژن‌های مختلف، این تکنیک هنوز برای استفاده بالینی آماده نیست (Roh et al., 2018; Carroll, 2019). اصلاحاتی که در سلول‌های زایشی رخ می‌دهد می‌تواند به نسل‌های آینده منتقل شود. دانشمندان فکر می‌کنند که می‌توانند با استفاده از CRISPR-Cas9 ژن‌هایی که باعث بیماری در جمعیت می‌شوند را استخراج کنند (Cai et al., 2018; Memi et al., 2018).
4. مسائل اخلاقی زیستی
این واقعیت که CRISPR-Cas9 یکی از مهم‌ترین اکتشافات قرن بیست و یکم است، به طور گسترده در جامعه علمی و صنایع مرتبط پذیرفته شده است. با این حال، افزایش سریع CRISPR-Cas9 منجر به مسائل اخلاقی زیستی، اجتماعی و قانونی جدیدی در پزشکی، کشاورزی، دامپروری و محیط زیست شده است. خطرات و مسائل اخلاقی زیستی احتمالی مربوط به CRISPR-Cas9 در جدول خلاصه شده است.
جدول
خطرات و مسائل اخلاقی زیستی احتمالی مربوط به فناوری CRISPR-Cas9.
ارگانیسمخطراتمسائل اخلاقی زیستیمراجعباکتریجهش‌های غیرهدفانحراف ژنعدم تعادل اکولوژیکیRodriguez, 2016 Hundleby and Harwood, 2019 Esvelt et al., 2014گیاهانجهش‌های غیرهدفانحراف ژنعدم تعادل اکولوژیکیPatentingshinwari et al., 2017 Hundleby and Harwood, 2019حیوانات / حیوانات ترکیبیجهش‌های غیرهدفعدم تعادل اکولوژیکیPatentinganimal welfare and dignity تهدید به کرامت و هویت انسانRodriguez, 2016 Polcz and Lewis, 2016 Rodriguez, 2017 Eriksson et al., 2018 Koplin, 2019 Degrazia, 2019انسانجهش‌های غیرهدفعوارض جانبیهزینه موزاییک ژنتیکیEugenic informed consent enhancement accessibility patenting safety incomplete or over legislationsOtieno, 2015 Rodriguez, 2016 Duardo-Sánchez, 2017 Shinwari et al., 2017 Greene and Master, 2018 Sherkow, 2018 Cathomen et al., 2019 Hirsch et al., 2019
4.1. عدم تعادل اکولوژیکی
در مطالعاتی که از روش‌های ویرایش RNA مبتنی بر CRISPR-Cas9 استفاده می‌کنند، اثرات غیرهدف باید به طور عمیق بررسی شوند. از آنجایی که انحراف ژن در یک جمعیت پایدار خواهد بود، جهش‌های غیرهدف احتمالی در هر نسل ادامه خواهند داشت. علاوه بر این، تعداد و اثر جهش‌ها ممکن است با پیشرفت نسل‌ها افزایش یابد (Rodriguez, 2016; Hundleby and Harwood, 2019). نگرانی دیگر، احتمال انتقال ژن‌ها به گونه‌های دیگر در محیط زیست است. انتقال توالی‌های تنظیم شده به گونه‌های دیگر ممکن است منجر به انتقال ویژگی‌های منفی به ارگانیسم‌های مرتبط شود (Esvelt et al., 2014). توزیع ویژگی‌های ژن‌های وارد شده در بین جمعیت‌ها می‌تواند کنترل را بسیار دشوار کند.
4.2. مقررات برای مصرف‌کنندگان
استفاده از CRISPR-Cas9 برای به دست آوردن اصلاحات ژنتیکی مورد نظر، شناسایی و تنظیم ارگانیسم‌های اصلاح شده ژنتیکی (GMO) در بازار پس از خروج از آزمایشگاه را بسیار دشوار می‌کند. بنابراین، سازمان‌های نظارتی مانند سازمان غذا و داروی ایالات متحده (FDA)، آژانس دارویی اروپا (EMA) و سایرین باید در نظر بگیرند که آیا GMOها برای مصرف‌کنندگان مناسب هستند یا خیر. با این حال، مشخص نیست که چگونه می‌توان امکان‌پذیری یک بازار در حال رشد با CRISPR-Cas9 را ارزیابی کرد (Ledford, 2015; Hundleby and Harwood, 2019).
یکی از معضلات CRISPR-Cas9 که برای همه بشریت نگران‌کننده است، ثبت اختراع است. همانطور که می‌دانید، ارگانیسم‌های تراریخته با استفاده صنعتی و همچنین برخی از توالی‌های ژنی انسانی برای اهداف بالینی ثبت اختراع شده‌اند (Rodriguez, 2016; Sherkow, 2018). با ادامه تکامل فناوری‌هایی مانند CRISPR، مسائل مربوط به ثبت اختراع در بسیاری از حوزه‌های بیوتکنولوژی به طور مداوم افزایش خواهد یافت. حتی در حال حاضر، موارد زیادی از این قبیل ثبت اختراع وجود دارد. مورد شناخته شده‌ترین مورد، پرونده حق ثبت اختراع بین Zhang و Doudna و Charpentier برای استفاده درمانی CRISPR-Cas9 در سلول‌های انسانی است. در پرونده‌ای که در 2 دسامبر 2016 به نتیجه رسید، تصمیم گرفته شد که حق ثبت اختراع به Caribou Biosciences، که Doudna بنیانگذار آن بود، اعطا شود (Donohoue et al., 2018).
4.3. ویرایش ژنوم برای تقویت
ویرایش سلول‌های زایشی انسان با CRISPR-Cas9 جنجال‌های اخلاقی جدی ایجاد کرده است. تا سال 2015، تمام کاربردهای درمانی در انسان در سلول‌های سوماتیک با استفاده از فناوری‌های ویرایش ژنوم انجام شده بود. با این حال، در سال 2015، ویرایش ژنوم زایشی انسان که توسط دانشمند چینی هوانگ و تیمش با CRISPR-Cas9 انجام شد، مسائل اخلاقی، اجتماعی و اخلاقی جدیدی را مطرح کرد (Liang et al., 2015; Ormond et al., 2017). مسائل اخلاقی زیستی ناشی از ویرایش ژنوم در زایگون را می‌توان بر اساس موفقیت یا عدم موفقیت فناوری‌های ویرایش ژنوم به دو دسته اصلی تقسیم کرد (Ormond et al., 2017; Greely, 2019).
4.3.1. مسائلی که ممکن است در صورت عدم موفقیت ویرایش ژنوم زایشی رخ دهد
برخی از معضلات اخلاقی ویرایش ژنوم زایشی ناشی از این واقعیت است که تغییرات در ژنوم می‌تواند به نسل‌های بعدی منتقل شود. ویرایش ژنوم درمانی در سلول‌های سوماتیک به طور کلی باعث نگرانی‌های قابل توجهی در ارزیابی تعادل خطر/منفعت و استفاده از رضایت آگاهانه نمی‌شود. استفاده از CRISPR-Cas9 در زایگون به دلیل خطر ایجاد جهش‌ها و اثرات جانبی مختلف و انتقال تغییرات نامطلوب به نسل‌های آینده، مشکل‌سازتر در نظر گرفته می‌شود (Cyranoski and Reardon, 2015; Brokowski, 2018; Cai et al., 2018; Halpern et al., 2019). در واقع، هوانگ و تیمش دریافتند که جهش‌های غیرهدف در ژنوم رخ داده است و مطالعه زودتر از برنامه‌ریزی شده متوقف شد (Liang et al., 2015). جهش‌های غیرهدف جهش‌های ناخواسته در ژنوم هستند و می‌توانند اثرات مضر بر روی ارگانیسم داشته باشند، زیرا این جهش‌ها می‌توانند منجر به مرگ سلول یا تبدیل شوند (Zhang et al., 2014). به طور ترسناکی، محققان دریافتند که جهش‌های ناشی از CRISPR-Cas9 در جنین‌ها بسیار شایع‌تر از سلول‌های موشی یا انسانی بالغ است (Cyranoski and Reardon, 2015). در یک مطالعه که بر روی جنین‌های انسان انجام شد، بیان شد که جهش‌های غیرهدف فقط در مناطق اگزون رخ می‌دهند و بنابراین تعداد جهش‌ها ممکن است بسیار بیشتر از حد انتظار باشد (Liang et al., 2015). به دلیل خطر بالای جهش‌های غیرهدف، برخی از دانشمندان استدلال می‌کنند که مطالعات ویرایش ژنوم در سلول‌های زایشی باید متوقف شود و آینده آن مورد بحث قرار گیرد (Cyranoski and Reardon, 2015). برخی از دانشمندان بیان می‌کنند که CRISPR-Cas9 جدیدتر می‌تواند تعداد جهش‌های غیرهدف را کاهش یا حتی از بین ببرد. در این روش، کارایی CRISPR-Cas9 با استفاده از iPSCهای انسانی تنظیم شده Cas9 در هدف‌گیری ژن خاص افزایش یافت (Yumlu et al., 2019).
معضل اخلاقی دیگر، هزینه ویرایش ژنوم زایشی است. ویرایش ژنوم یک فناوری پرهزینه است (Wilson and Carroll, 2019). در حالی که خانواده‌های کشورهای ثروتمند ممکن است قدرت پوشش این هزینه را داشته باشند، خانواده‌های کشورهای در حال توسعه ممکن است نتوانند. این وضعیت ممکن است باعث شود که کودکانی که در کشورهای توسعه‌یافته متولد می‌شوند، در مقایسه با کودکانی در سایر کشورها، از نظر ویژگی‌های مختلفی مانند هوش و وضعیت جسمانی، مزیت ناعادلانه‌ای داشته باشند (Otieno, 2015).
CRISPR-Cas9 بر اساس استفاده از آنزیم‌های نوکلئاز است. آنزیم‌های نوکلئازی که استفاده می‌شوند ممکن است به اندازه کافی مؤثر نباشند و قادر به برش تمام کپی‌های ژن هدف نباشند، یا ممکن است سلول قبل از تکمیل ویرایش ژنوم شروع به تقسیم کند. در نتیجه، وضعیتی به نام موزاییک ژنتیکی می‌تواند رخ دهد (Lanphier et al., 2015). موزاییک ژنتیکی وجود جمعیت‌های سوماتیک از نظر ژنتیکی متفاوت در یک ارگانیسم است و اغلب پنهان است. موزاییک می‌تواند منجر به تغییرات فنوتیپی عمده، ایجاد جهش‌های ژنتیکی مرگبار (Capalbo and Rienzi, 2017) و برخی از بیماری‌های ژنتیکی مانند سندرم داون، کلاین‌فلتر و ترنر شود (Otieno, 2015). بنابراین، محل‌های برش نوکلئاز باید دقیقاً تأیید شوند و احتمال موزاییک باید به طور کامل از بین برود.
یکی دیگر از مسائل اخلاقی مهم، اثرات جانبی در جنین‌ها است. اشاره شده است که اثرات جانبی احتمالی را نمی‌توان قبل از تولد پیش‌بینی کرد و پیامدها ناشناخته است (Otieno, 2015; Brokowski, 2018). کنترل‌ها فقط می‌توانند در یک گروه کوچک از سلول‌ها انجام شوند. این محدودیت باعث می‌شود که اثرات ویرایش ژنوم بر روی جنین‌ها ناشناخته و غیرقابل پیشگیری باشد تا زمان تولد. در واقع، باید در نظر داشت که ممکن است سال‌ها طول بکشد تا بسیاری از مشکلات احتمالی ظاهر شوند (Lanphier et al., 2015; Halpern et al., 2019).
4.7.2. مسائلی که ممکن است در صورت موفقیت ویرایش ژنوم زایشی رخ دهد
اولین مسئله اخلاقی ویرایش ژنوم زایشی موفق، استفاده برای تغییرات غیردرمانی است (Lanphier et al., 2015; Greely, 2019). چنین استفاده‌هایی منجر به سوالات جدیدی در مورد اصلاح نژاد (نژادپرستی) گونه‌های انسانی و جایگاه آن در جهان می‌شود (Yang, 2015). در یک مطالعه، رنگ پوست موش‌ها با موفقیت با استفاده از ویرایش ژنوم تغییر کرد (Yoshimi et al., 2014). این امکان وجود دارد که رنگ پوست افراد نیز در آینده تغییر کند. از آنجایی که ویژگی‌های افراد می‌تواند با ویرایش ژنوم تعیین شود و نه از طریق روابط خونی، این احتمال وجود دارد که کودکانی با ویژگی‌های فیزیکی و ذهنی مشابه در یک روش متولد شوند (Ishi, 2015).
مسئله اخلاقی دیگر، سرنوشت کودکانی است که با استفاده از ویرایش ژنوم متولد می‌شوند. از چه کسی یا کجا رضایت آگاهانه در صورت بروز اثرات نامطلوب از طرف کودکان ویرایش شده ژنوم گرفته شود و آیا رضایت آگاهانه اطلاعات دقیقی در مورد خطرات احتمالی ارائه می‌دهد، سوالات مهمی هستند (Beriain and del Cano, 2018; Neuhaus and Zacharias, 2018; Sykora, 2018; Knoppers and Kleiderman, 2019). در حالی که رضایت آگاهانه واضح می‌تواند برای ویرایش ژنوم سلول‌های سوماتیک در آزمایش‌های بالینی داده شود، به دست آوردن اطلاعات دقیق در مورد خطرات و مزایای احتمالی در ویرایش زایگون یک معما است (Lanphier et al., 2015; Neuhaus and Zacharias, 2018; Knoppers and Kleiderman, 2019).
در دسامبر 2015، اجلاس بین‌المللی ویرایش ژنوم انسانی برای بحث در مورد مسائل اجتماعی، اخلاقی و اخلاقی ناشی از ویرایش ژنوم در زایگون انسان برگزار شد. نتایج این اجلاس به این نتیجه رسید که تحقیقات اساسی و بالینی باید مطابق با مقررات قانونی و اخلاقی مناسب ادامه یابد. با این حال، ویرایش ژنوم در گامت‌ها و جنین‌هایی که منجر به تغییرات ارثی در انسان می‌شود، غیرمسئولانه تلقی شد. بنابراین، تأکید شد که استفاده از CRISPR-Cas9 در زایگون انسان باید تا زمانی که راه حلی برای نگرانی‌ها و مسائل اخلاقی، اجتماعی، قانونی و فنی موجود پیدا شود، به تعویق بیفتد (Baltimore et al., 2015). علاوه بر این، توافق شد که یک انجمن بین‌المللی ایجاد شود که در آن بتوان این نگرانی‌ها را به طور مداوم مورد بحث قرار داد و مطالعات در کشورهای مختلف به طور مشترک سازماندهی شوند (Baltimore et al., 2015; Lanphier et al., 2015; Olson, 2015). NIH اعلام کرد که از تحقیقات ویرایش ژنوم در جنین‌های انسان از نظر مالی حمایت نخواهد کرد (Collins, 2015). با وجود تصمیمات مشترکی که گرفته شد، در فوریه 2016، دانشمندان بریتانیایی مجاز به استفاده از CRISPR-Cas9 و فناوری‌های مشابه در جنین‌های انسان فقط برای اهداف تحقیقاتی شدند (https://www.bbc.com/news/health-35459054). در مارس 2017، آکادمی ملی علوم ایالات متحده و انجمن ژنتیک انسانی بیانیه موضعی منتشر کردند که بیان می‌کردند که باید از مسائل علمی و اخلاقی ناشی از ویرایش ژنوم زایشی آگاه باشند، اما در عین حال، تحقیقات باید ادامه یابد (Ormond et al., 2017). از ژانویه 2020، 24 کشور با قانون و 9 کشور با دستورالعمل، ویرایش ژنوم در جنین‌های انسان را ممنوع کرده‌اند. با این حال، کشورهایی وجود دارند که ممنوعیت‌های سختگیرانه‌ای بر ویرایش ژنوم زایشی اعمال نمی‌کنند (Ishii, 2017a; Lau et al., 2018; Macintosh, 2019).
5. بحث و جهت‌گیری‌های آینده
به لطف دقت بالا، سهولت استفاده و هزینه نسبتاً پایین، CRISPR-Cas9 طیف گسترده‌ای از کاربردها را برای بسیاری از افراد در بخش‌های پزشکی، کشاورزی، دامپروری و محیط زیست ارائه می‌دهد. علاوه بر این، دقت و صحت آن بسیار بالاتر از فناوری‌های قدیمی‌تر مانند ZFN و TALEN است (Mittal, 2019). اثرات قدرتمند CRISPR-Cas9 مسائل اجتماعی، اخلاقی و قانونی متعددی را ایجاد کرده است.
بحث‌ها به طور کلی بر مسائل اجتماعی، اخلاقی و قانونی استفاده از CRISPR-Cas9 در سلول‌های زایشی انسان متمرکز شده است. دانشمندان به طور کلی موافقند که CRISPR-Cas9 باید برای ایجاد مدل‌های بیماری انسانی و درک توسعه و مکانیسم‌های مولکولی بیماری‌ها مجاز باشد، اما باید از اهداف نژادپرستی یا تقویت منع شود. با در نظر گرفتن مسائل اخلاقی، نگرانی‌های ایمنی و مشکلات کاربردی، پیش‌بینی می‌شود که ویرایش ژنوم درمانی در جنین‌های انسان در آینده نزدیک امکان‌پذیر نباشد. بنابراین، خطر جهش‌های ژنتیکی ارثی بیشتر از مزایای درمانی احتمالی است و اصل عدم آسیب را نقض می‌کند. با این حال، واضح است که دانشمندان در آینده در صورت یافتن راه‌حل‌هایی برای مسائل ذکر شده، از CRISPR-Cas9 در سلول‌های زایشی استفاده خواهند کرد (Duardo-Sánchez, 2017; Hirsch et al., 2019). CRISPR-Cas9 باید کاملاً قابل اعتماد برای استفاده درمانی در سلول‌های زایشی باشد. مسائل اجتماعی، قانونی و اخلاقی باید به طور مفصل مورد بحث قرار گیرند و پس از دستیابی فناوری‌های ویرایش ژنوم به سطح قابل قبول ایمنی برای کاربردهای بالینی در پیشگیری از بیماری‌های ژنتیکی، قوانین لازم تهیه و با آگاهی عمومی به اشتراک گذاشته شوند (Rodriguez, 2016; Duardo-Sánchez, 2017; Cathomen et al., 2019; Macintosh, 2019). در نتیجه، یک سیاست بلندمدت می‌تواند توسعه علمی فناوری CRISPR-Cas9 را با بحث در مورد مشکلات احتمالی از قبل و تهیه طرح‌های راه‌حل همراه کند.
از طرف دیگر، نباید اثرات بالقوه CRISPR-Cas9 در سایر زمینه‌ها را نادیده گرفت. CRISPR-Cas9 فقط در مورد مسائل اجتماعی و اخلاقی مربوط به مردم نیست. تعامل با سایر ارگانیسم‌ها و محیط زیست، مانند در نظر گرفتن اصل عدم آسیب در ارزیابی خطر، اقدامات ایمنی برای جلوگیری از تخریب اکولوژیکی یا استفاده بالقوه در تقویت ژنتیکی حیوانات و محصولات کشاورزی نیز باید مورد بحث قرار گیرد (Rodriguez, 2016; Hirsch et al., 2019). نگرانی‌های جدی در مورد تغییرات در اکوسیستم طبیعی وجود دارد که ممکن است در صورت انتشار GMOهای تولید شده با CRISPR-Cas9 به اکوسیستم به صورت کنترل شده یا غیرقابل کنترل رخ دهد. با در نظر گرفتن کاربردهای CRISPR-Cas9 برای محافظت از پشه‌ها در برابر انگل‌های مالاریا (Gantz et al., 2015) یا عقیم کردن پشه‌های ماده در آزمایشگاه (Hammond et al., 2016)، اثر پشه‌های GM بر روی سایر ارگانیسم‌هایی که با آن‌ها در اکوسیستم خود مرتبط هستند، قابل پیش‌بینی نیست. واضح است که تحقیقات در مقیاس کوچک در آزمایشگاه نمی‌تواند به طور کامل تغییرات احتمالی در اکوسیستم طبیعی را منعکس کند (Carroll, 2017). در کشاورزی، نگرانی دیگر پذیرش GMOها توسط عموم مردم است. GMOهایی که با استفاده از فناوری‌های مختلف در گذشته تولید شده‌اند، با واکنش‌های شدید عمومی مواجه شده‌اند (Carroll, 2017). علاوه بر این، این واقعیت که GMOهای تولید شده با CRISPR-Cas9 را نمی‌توان خارج از آزمایشگاه شناسایی کرد، نگرانی‌های ایمنی را افزایش می‌دهد (Shinwari et al., 2017). قبل از عرضه چنین محصولاتی، مقامات باید توضیحات و اعلامیه‌های لازم را به طور شفاف و واضح ارائه دهند تا از سوءتفاهم‌ها و سوالات احتمالی جلوگیری کنند و اقدامات احتیاطی و ترتیبات لازم برای اطمینان از ایمنی عمومی ایجاد شود.
مسئله دیگری که باید در مورد CRISPR-Cas9 در نظر گرفته شود، ثبت اختراع است. ثبت اختراع می‌تواند کاربرد این فناوری‌ها را به طور قابل توجهی محدود کند. ثبت اختراع یک‌جانبه می‌تواند سودآوری شرکت‌های بیوتکنولوژی را به طور قابل توجهی افزایش دهد که ممکن است منجر به ایجاد مسائل اخلاقی زیستی شود. اختلاف نظرهایی در جامعه علمی در مورد ثبت اختراع یا عدم ثبت اختراع GMOها به ویژه برای اهداف درمانی وجود دارد (Shinwari et al., 2017; Sherkow, 2018). با این حال، برخی معتقدند که ثبت اختراع به حذف و تنظیم کمبودها در این زمینه کمک می‌کند (Rodriguez, 2016; Shinwari et al., 2017). باید توجه داشت که مهم‌ترین این بحث‌ها در مورد ثبت اختراع، تجاری‌سازی و انتشار محصولات قابل اعتماد است.
معاملات بین جامعه علمی و بخش‌های داروسازی و بیوتکنولوژی برای استفاده درمانی از CRISPR-Cas9 نگرانی‌های ایمنی عمومی را افزایش داده است (Shinwari et al., 2017; Carroll, 2019). قوانین و مقررات لازم برای تنظیم محتوا و کاربرد این معاملات باید در اسرع وقت تهیه و با عموم به اشتراک گذاشته شود. با توجه به چالش‌ها و مسائل اخلاقی زیستی CRISPR-Cas9، جامعه علمی و سایر طرف‌های ذینفع اخلاقی، اجتماعی، قانونی و دولتی باید یک راهنمای دقیق برای پردازش و استفاده آینده از این فناوری ارائه دهند (Otieno, 2015; Shinwari et al., 2017; Cathomen et al., 2019). به این ترتیب، می‌توان یک سیاست بلندمدت ایجاد کرد که توسعه علمی فناوری CRISPR-Cas9 را با بحث در مورد مشکلات احتمالی از قبل و تهیه طرح‌های راه‌حل همراه کند.
مراجع

Amoasii L Hildyard JC Li H Sanchez-Ortiz E Mireault A Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2018;362:86. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Amoroso PJ Wenger LL Beam TE Sparacino LR Pellegrino ED Hartle AE Howe EG The human volunteer in military biomedical research. Military Medical Ethics. 2003;2:563. [Google Scholar]
Arévalo MT Navarro A Arico CD Li J Alkhatib O Targeted silencing of anthrax toxin receptors protects against anthrax toxins. Journal of Biological Chemistry. 2014;289:15730. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Baltimore D Berg P Botchan M Carroll D Charo RA A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification. Science. 2015;348:36. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Barrangou R Fremaux C Deveau H Richards M Boyaval P CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 2007;315:1709. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Gene editing in human embryos. A comment on the ethical issues involved. The Ethics of Reproductive Genetics. Cham. 2018. p. 173.
Black CK Termanini KM Aguirre O Hawksworth JS Sosin M Solid organ transplantation in the 21st century. Annals of Translational Medicine. 2018;6:409–409. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Brokowski C Do CRISPR germline ethics statements cut it. CRISPR Journal. 2018;1:115. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Cai L Zheng LA He L The forty years of medical genetics in China. Journal of Genetics and Genomics. 2018;45:569. [PubMed] [Google Scholar]
Carroll D Focus: Genome editing: genome editing: past, present, and future. Yale Journal of Biology and Medicine. 2017;90:653–653. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
The human genome editing race: loosening regulatory standards for commercial advantage? Trends in Biotechnology 37 (2. 2019. p. 120. [PubMed]
Charlesworth CT Deshpande PS Dever DP Camarena J Lemgart VT Identification of preexisting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans. Nature Medicine. 2019;25:249–249. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Chen H Kazemier HG de Groote ML Ruiters MH Xu GL Induced DNA demethylation by targeting ten-eleven translocation 2 to the human ICAM-1 promoter. Nucleic Acids Research. 2013;42:1563. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
CRISPR-Cas9 Therapeutics: A Technology Overview 2015.
Statement on NIH Funding of Research Using Gene-Editing Technologies in Human Embryos 2015.
Cornelis MC Nugent NR Amstadter AB Koenen KC Genetics of post-traumatic stress disorder: review and recommendations for genome-wide association studies. Current Psychiatry Reports. 2010;12:313. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Cyranoski D Reardon S Chinese scientists genetically modify human embryos. Nature News. 2015;346:1258096–1258096. [Google Scholar]
de Graeff N Jongsma KR Johnston J Hartley S Bredenoord AL The ethics of genome editing in non-human animals: a systematic review of reasons reported in the academic literature. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 2019;374:20180106–20180106. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Degrazia D Human-animal chimeras, “human” cognitive capacities, and moral status. Hastings Center Report. 2019;49:33. [PubMed] [Google Scholar]
Doudna JA Charpentier E The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346:1258096–1258096. [PubMed] [Google Scholar]
Duardo-Sanchez A CRISPR-Cas in medicinal chemistry: applications and regulatory concerns. Current Topics in Medicinal Chemistry. 2017;17:3308. [PubMed] [Google Scholar]
Duchêne BL Cherif K Iyombe-Engembe JP Guyon A Rousseau J CRISPR-induced deletion with saCas9 restores dystrophin expression in dystrophic models in vitro and in vivo. Molecular Therapy. 2018;26:2604. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Eriksson S Jonas E Rydhmer L Röcklinsberg H Invited review: Breeding and ethical perspectives on genetically modified and genome edited cattle. Journal of Dairy Science. 2018;101:1. [PubMed] [Google Scholar]
Esvelt KM Smidler AL Catteruccia F Church GM Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. Elife. 2014;3:e03401–e03401. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Firth AL Menon T Parker GS Qualls SJ Lewis BM Functional gene correction for cystic fibrosis in lung epithelial cells generated from patient iPSCs. Cell Reports. 2015;12:1385. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Fung RKF Kerridge IH Gene editing advance re-ignites debate on the merits and risks of animal to human transplantation. Internal Medicine Journal. 2016;46:1017. [PubMed] [Google Scholar]
Gantz VM Jasinskiene N Tatarenkova O Fazekas A Macias VM Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2015;112:E6736. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Greely HT Human germline genome editing: an assessment. CRISPR Journal. 2019;2:253. [PubMed] [Google Scholar]
Greene M Z Ethical issues of using CRISPR technologies for research on military enhancement. Journal of Bioethical Inquiry. 2018;15:327. [PubMed] [Google Scholar]
Greenfield A Editing mammalian genomes: ethical considerations. Mammalian Genome. 2017;28:388. [PubMed] [Google Scholar]
Guo X Li XJ Targeted genome editing in primate embryos. Cell Research. 2015;25:767–767. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Halpern J Hara O Doxzen SE Witkowsky KW Owen LB AL Societal and ethical impacts of germline genome editing: How can we secure human rights? CRISPR Journal. 2019;2:293. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Hirsch F Iphofen R Z Ethics assessment in research proposals adopting CRISPR technology. Biochemia Medica. 2019;29:206. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Huisman C van der Wijst MG Falahi F Overkamp J Karsten G Prolonged re-expression of the hypermethylated gene EPB41L3 using artificial transcription factors and epigenetic drugs. Epigenetics. 2015;10:384. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Ishii T Genome-edited livestock: ethics and social acceptance. Animal Frontiers. 2017a;7:24. [Google Scholar]
Ishii T Germ line genome editing in clinics: the approaches, objectives and global society. Briefings in Functional Genomics. 2017b;16:46. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Kim H Kim JS A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nature Reviews Genetics. 2014;15:321. [PubMed] [Google Scholar]
Kim S Koo T Jee HG Cho HY Lee G CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells. Genome Research. 2018;28:367. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Knoppers BM Kleiderman E Heritable genome editing: Who speaks for “future” children? CRISPR Journal. 2019;2:285. [PubMed] [Google Scholar]
Koo T Lu-Nguyen NB Malerba A Kim E Kim D Functional rescue of dystrophin deficiency in mice caused by frameshift mutations using campylobacter jejuni Cas9. Molecular Therapy. 2018;26:1529. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Koplin JJ Human-animal chimeras: the moral insignificance of uniquely human capacities. Hastings Center Report. 2019;49:23. [PubMed] [Google Scholar]
Lanphier E Urnov F Haecker SE Werner M Smolenski J Don’t edit the human germ line. Nature News. 2015;519:410–410. [PubMed] [Google Scholar]
Lau RW Wang B Ricardo SD Gene editing of stem cells for kidney disease modelling and therapeutic intervention. Nephrology. 2018;23:981. [PubMed] [Google Scholar]
Lau V Davie JR The discovery and development of the CRISPR system in applications in genome manipulation. Biochemistry and Cell Biology. 2016;95:203. [PubMed] [Google Scholar]
Ledford H CRISPR, the disruptor. Nature. 2015;522:20. [PubMed] [Google Scholar]
Li W Teng F Li T Zhou Q Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 2013;31:684–684. [PubMed] [Google Scholar]
Liang P Xu Y Zhang X Ding C Huang R CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.  Protein & Cell. 2015;6:363. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Liao J Karnik R Gu H Ziller MJ Clement K Targeted disruption of DNMT1, DNMT3A and DNMT3B in human embryonic stem cells. Nature Genetics. 2015;47:469–469. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Long C Li H Tiburcy M Rodriguez-Caycedo C Kyrychenko V Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single-site genome editing. Science Advances. 2018;4:eaap9004–eaap9004. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Macintosh KL Heritable genome editing and the downsides of a global moratorium. CRISPR Journal. 2019;2:272. [PubMed] [Google Scholar]
Manesh SB Samani RO Manesh SB Ethical issues of transplanting organs from transgenic animals into human beings. Cell Journal (Yakhteh) 2014;16:353–353. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Marraffini LA Sontheimer EJ CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 2008;322:1843. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Martinelli L Oksanen M Siipi H De-extinction: a novel and remarkable case of bio-objectification. Croatian Medical Journal. 2014;55:423–423. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Mei Y Wang Y Chen H Sun ZS Ju XD Recent progress in CRISPR/Cas9 technology. Journal of Genetics and Genomics. 2016;43:63. [PubMed] [Google Scholar]
Memi F Ntokou A Papangeli I CRISPR/Cas9 gene-editing: Research technologies, clinical applications and ethical considerations. Seminars in Perinatology. 2018;42:487. [PubMed] [Google Scholar]
Mittal RD Gene editing in clinical practice: where are we? Indian Journal of Clinical Biochemistry. 2019;34:19. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Neuhaus CP Zacharias RL Compassionate use of gene therapies in pediatrics: an ethical analysis. Seminars in Perinatology. 2018;42:508. [PubMed] [Google Scholar]
Niu YY Shen B Cui YQ Chen YC Wang JY Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014;156:836. [PubMed] [Google Scholar]
International Summit on Human Gene Editing: A Global Discussion 2016. [PubMed]
Ormond KE Mortlock DP Scholes DT Bombard Y Brody LC Human germline genome editing. American Journal of Human Genetics. 2017;101:167. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Otieno MO CRISPR-Cas9 human genome editing: challenges, ethical concerns and implications. Journal of Clinical Research and Bioethics. 2015;6:253. [Google Scholar]
Oye KA Esvelt K Appleton E Catteruccia F Church G Regulating gene drives. Science. 2014;345:626. [PubMed] [Google Scholar]
Polcz S Lewis A CRISPR-Cas9 and the non-germline non-controversy. Journal of Law and the Biosciences. 2016;3:413. [Google Scholar]
Ramanan V Shlomai A Cox DB Schwartz RE Michailidis E CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Scientific Reports. 2015;5:10833–10833. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Rath D Amlinger L Rath A Lundgren M The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. Biochimie. 2015;117:119. [PubMed] [Google Scholar]
Rodriguez E Ethical issues in genome editing using Crispr/Cas9 system.  Journal of Clinical Research and Bioethics  2016;7:266–266. [Google Scholar]
Rodriguez E Ethical issues in genome editing for non-human organisms using CRISPR/Cas9 system. Journal of Clinical Research and Bioethics. 2017;8:10. [Google Scholar]
Rodriguez E Keiser M McLoughlin H Zhang F Davidson BL AAV-CRISPR: a new therapeutic approach to nucleotide repeat diseases. Molecular Therapy. 2014;22:94. [Google Scholar]
Roh DS Li EBH Liao EC CRISPR Craft: DNA editing the reconstructive ladder. Plastic and Reconstructive Surgery. 2018;142:1355. [PubMed] [Google Scholar]
Rossant J Gene editing in human development: ethical concerns and practical applications. Development. 2018;145:dev150888–dev150888. [PubMed] [Google Scholar]
Schultz-Bergin M The dignity of diminished animals: Species norms and engineering to improve welfare. Ethical Theory and Moral Practice. 2017;20:843. [Google Scholar]
Schultz-Bergin M Is CRISPR an ethical game changer. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 2018;31:219. [Google Scholar]
Senis E Fatouros C Große S Wiedtke E Niopek D CRISPR/Cas9-mediated genome engineering: an adeno-associated viral (AAV) vector toolbox. Biotechnology Journal  2014;9:1402. [PubMed] [Google Scholar]
Sherkow S The CRISPR patent landscape: past, present, and future. CRISPR Journal. 2018;1:5. [PubMed] [Google Scholar]
Shinwari ZK Tanveer F Khalil AT Ethical issues regarding CRISPR-mediated genome editing. Current Issues in Molecular Biology. 2017;26:103. [PubMed] [Google Scholar]
Shriver A McConnachie E Genetically modifying livestock for improved welfare: a path forward. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 2018;31:161. [Google Scholar]
Swiech L Heidenreich M Banerjee A Habib N Li Y In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 2015;33:102–102. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Thinking Towards the Future of CRISPR/Cas9 2015.
Yang W Tu Z Sun Q Li XJ CRISPR/Cas9: implications for modeling and therapy of neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 2016;9 [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Yoshimi K Kaneko T Voigt B Mashimo T Allele-specific genome editing and correction of disease-associated phenotypes in rats using the CRISPR–Cas platform. Nature Communications. 2014;5:4240–4240. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Yuan M Gao X Chard LS Ali Z Ahmed J A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 2015;2:15035–15035. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
Efficient gene editing of human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. CRISPR Gene Editing. 2019. p. 137. [PubMed] [Google Scholar]
Zhang F Wen Y Guo X CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges. Human Molecular Genetics. 2014;23:40. [PubMed] [Google Scholar]
Zhang XL Wei P Xin-Tian H Jia-Li L Yong-Gang Y Experimental primates and non-human primate (NHP) models of human diseases in China: current status and progress. Zoological Research. 2014;35:447–447. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

Articles from Turkish Journal of Biology are provided here courtesy of The Scientific and Technological Research Council of Turkey


فهرست مجلات
Springer Nature - مجموعه PMC COVID‑19
PMC9377665

چکیده
توسعه روشی برای ویرایش ژنوم مبتنی بر فناوری CRISPR‑Cas9 در سال 2020 جایزه نوبل شیمی را به‌دست آورد، کمتر از یک دهه پس از کشف تمام اجزای مولکولی اصلی این سیستم. برای اولین بار در تاریخ، جایزه نوبل به دو زن، امانوئل شارپنتیه و جنیفر دودنا، که کشفیات کلیدی در زمینه دستکاری DNA با سیستم CRISPR‑Cas9، که به‌نام «قیچی‌های ژنتیکی» شناخته می‌شود، اعطا شد. اهمیت این تکنیک را نمی‌توان بیش از حد برآورد؛ چرا که نه تنها امکان دستکاری ژنوم‌های موجودات مدل در آزمایش‌های علمی، بلکه تغییر ویژگی‌های محصولات کشاورزی و حیوانات مهم را فراهم می‌کند و پتانسیل ایجاد تغییرات انقلابی در پزشکی، به‌ویژه در درمان بیماری‌های ژنتیکی را دارد. عملکرد زیستی اصلی سیستم CRISPR‑Cas9، محافظت از پروکاریوت‌ها در برابر عناصر ژنتیکی متحرک، به‌ویژه ویروس‌ها است. امروزه، CRISPR‑Cas9 و فناوری‌های مرتبط با آن برای درمان بیماری‌های تهدیدکننده حیات، ساخت تست‌های تشخیص کروناویروس و حتی تغییر سلول‌های جنین انسانی به‌کار رفته‌اند که منجر به تولد نوزادانی شد که تغییرات وارد شده را حمل می‌کردند. این مداخله با سلول‌های ژن‌ساز انسانی به دلیل نگرانی‌های اخلاقی در جامعه علمی به‌طور گسترده‌ای مورد انتقاد قرار گرفت و خواستار تعلیق ویرایش‌های ژنومی ارثی شد. این مرور به تاریخچه کشف سیستم CRISPR‑Cas9 و برخی جنبه‌های کاربردهای فعلی آن، از جمله نگرانی‌های اخلاقی درباره استفاده از آن در انسان می‌پردازد.

کلیدواژه‌ها: CRISPR‑Cas9، ویرایش ژنوم، «قیچی‌های ژنتیکی»، ملاحظات اخلاقی

**تاریخچه کشف اجزای اصلی سیستم CRISPR‑Cas9**
CRISPR – تکرارهای کوتاه پالیندرمیک به‌صورت منظم و فواصل‌دار – برای اولین بار در توالی‌های DNA باکتری *Escherichia coli* کشف شد و در سال 1987 توسط ایشینو و همکاران (دانشگاه اوساکا، ژاپن) توصیف شد. در آن زمان توالی‌یابی این قطعات دشوار چندین ماه طول می‌کشید و نه منشا و نه اهمیت آن‌ها در سلول باکتری برای کشف‌کنندگان روشن نبود. اگرچه در کارهای اولیه عملکرد زیستی سیستم CRISPR هنوز مشخص نشده بود، دانشمندان پیشاپیش پیشنهاد استفاده از اطلاعات کدگذاری‌شده در لوکوس‌های CRISPR برای تحقیقات پزشکی، به‌ویژه برای ژنوتیپینگ انواع مختلف باکتری‌ها، دادند: ابتدا در *Mycobacterium tuberculosis* و سپس در *Streptococcus pyogenes*. مشخص شد که لوکوس‌های CRISPR در سویه‌های مختلف یک گونه باکتری پاتوژنیک پلی‌مورفیسم بالایی دارند که امکان شناسایی سویه‌های باکتری در شرایط بالینی را فراهم می‌کند.

یک پیشرفت مهم در درک عملکرد زیستی لوکوس‌های CRISPR با کشف فرانسیسکو موژیکا (دانشگاه آلیکانته، اسپانیا) در سال 1995 رخ داد؛ او ساختارهای مشابهی را در ژنوم آرکئال *Haloferax mediterranei* یافت. حضور این عناصر در دو حوزه تکاملی دور، اهمیت عملکردی بالای آن‌ها را نشان می‌داد و محرکی برای تحقیقات بیشتر شد. موژیکا شباهت این عناصر در آرکئا را با تکرارهای DNA که پیش‌تر در ژنوم‌های باکتری کشف شده بود، متوجه شد و یکی از اولین دانشمندانی بود که فرض کرد این لوکوس‌های غیرعادی شامل قطعات DNA خارجی هستند و در واقع بخشی از سیستم ایمنی باکتری‌ها و آرکئا می‌باشند. در همان سال، دو آزمایشگاه دیگر به‌طور مستقل به نتایج مشابهی رسیدند و آغاز دوره‌ای از پژوهش فعال بر این پدیده طبیعی شگفت‌انگیز را اعلام کردند. بر پایه نظریه سیستم ایمنی پروکاریوتیک، قطعات DNA ویروسی («اسپیسِرها» با طول 17‑84 باز) که توسط تکرارهای پالیندرمیک کوتاه (23‑50 باز) جدا می‌شوند و در نواحی بین‌ژنیک به‌صورت خوشه‌ها گروه‌بندی می‌شوند، کتابخانه‌ای از اطلاعات ژنتیکی بالقوه خطرناک را تشکیل می‌دهند. در ابتدا تصور می‌شد این سیستم از طریق مکانیزم تداخل RNA کار می‌کند؛ اما در مقاله مارافینی و سونتهیمیر به‌صورت تجربی نشان داده شد که هدف واقعی سیستم ایمنی پروکاریوتیک DNA خارجی است، نه mRNA، و بنابراین استفاده از این سیستم در آزمایشگاه می‌تواند ابزار بالقوه‌ای برای ویرایش ژنوم باشد. مطالعات بعدی نشان دادند برخی از سیستم‌های CRISPR مستقیماً با مولکول‌های RNA کار می‌کنند و می‌توانند به‌صورت انتخابی رونویس‌های خاص داخل سلول را غیرفعال کنند.

اولین اطلاعات تجربی درباره مکانیزم عمل سیستم CRISPR در سال 2007 توسط دو دانشمند فرانسوی غذا، رودولف بارانگو و فیلیپ هوروات، که با کشت‌های ماست *Streptococcus thermophilus* برای شرکت دانسکو (دانمارک) کار می‌کردند، به‌دست آمد. به‌دلیل مجموعه غنی کشت‌های باکتریایی این شرکت از دهه 1980، دانشمندان توانستند مسیر تاریخی افزودن اسپیسِرهای جدید به لوکوس CRISPR در پاسخ به حملات ویروسی باکتریوفاژها را ردیابی کنند. افزودن اسپیسِرهای جدید منجر به ایمنی اکتسابی در برابر باکتریوفاژهای جدید شد؛ این مشاهده منجر به دریافت یکی از اولین پتنت‌ها در این حوزه و آغاز «واکسیناسیون» کشت‌های باکتریایی با فناوری مبتنی بر CRISPR توسط دانسکو در سال 2005 شد.

امروزه تکرارهای CRISPR در اکثر ژنوم‌های آرکئال و تقریباً نیمی از باکتری‌های مورد بررسی یافت می‌شوند، اما در توالی‌های DNA یوکاریوت یا ویروسی مشاهده نشده‌اند. وجود تکرارهای CRISPR در میتوکندری در یکی از نخستین مقالات درباره این موضوع (که همان مقاله برای اولین بار CRISPR را در سیانوباکتری‌ها توصیف کرد) پیشنهاد شد؛ اما این ادعا در مطالعات بعدی تأیید نشد.

در زمان کشف اولیه، گروه‌های علمی مختلف از مخفف‌های متفاوتی برای CRISPR استفاده می‌کردند که جستجوی مقالات اولیه را دشوار می‌سازد. نام فعلی CRISPR برای اولین بار در مقاله جانسن و همکاران (2002) ظاهر شد و توسط موژیکا در مکاتبه‌ای بین دو گروه علمی پیشنهاد شد. همان مقاله اولین بار وجود ژن‌های مرتبط با تکرارهای CRISPR (که به‌نام cas1‑4 شناخته شدند) را توصیف کرد. این ژن‌ها در نزدیکی لوکوس‌های CRISPR در پروکاریوت‌ها یافت شدند و دو تا از آن‌ها موتیف‌های هلیکاز و نوکلئاز داشتند که فرضیهٔ ارتباط غیرتصادفی این ژن‌ها با لوکوس CRISPR و نقش آن‌ها در متابولیسم DNA را تقویت می‌کرد. در همان سال، تیمی به رهبری یوجین کونین (NCBI) نیز این ژن‌ها را شناسایی کرد، اما ارتباط آن‌ها با آرایه‌های CRISPR را تشخیص نداد. از زمان کشف اولین ژن‌های مرتبط با سیستم CRISPR تا به امروز، تنوع و فراوانی شگفت‌انگیز آن‌ها در سلول‌های پروکاریوتی کشف شده است؛ شامل خانواده‌های هلیکازها، نوکلئازها، پلیمرازها و غیره. پروتئین‌های مرتبط می‌توانند به دو ماژول تقسیم شوند: ماژول تطبیقی (درگیر در اکتساب ایمنی؛ نمایندگان اصلی Cas1 و Cas2) و ماژول افکتور (مستقیم در تخریب عناصر ژنتیکی متحرک از طریق شناسایی و برش)؛ همچنین پروتئین‌های تنظیمی و کمکی نیز وجود دارند. در حال حاضر، طبقه‌بندی‌ای پذیرفته شده است که تمام سیستم‌های CRISPR‑Cas شناخته‌شده را به ۲ کلاس و ۶ نوع تقسیم می‌کند که هر کدام به زیرنوع‌های متعدد تقسیم می‌شوند؛ تا زمان نوشتن این مرور، ماکاروا و همکاران بیش از ۳۰ زیرنوع را توصیف کرده‌اند. تفاوت اصلی بین کلاس‌ها این است که ماژول افکتور کلاس ۱ توسط مجموعه‌ای از پروتئین‌ها تشکیل می‌شود، در حالی که در کلاس ۲ یک پروتئین چنددامنه‌ای (Cas9، Cas12 یا Cas13) عمل می‌کند.

**طبقه‌بندی متعارف سیستم‌های CRISPR‑Cas شناخته‌شده**

از میان تمام پروتئین‌های Cas، بیشترین مطالعه بر روی پروتئین‌های مربوط به برش جهت‌دار DNA خارجی (و همان‌طور که بعدها مشخص شد، در برخی موارد RNA) انجام شده است؛ به‌نام «قیچی‌های ژنتیکی»، که نوکلئاز Cas9 یکی از آن‌هاست. این پروتئین اولین بار در ارتباط با تکرارهای CRISPR توسط بولوتین و همکاران توصیف شد؛ در آن مقاله به‌عنوان Cas5 (نام‌های جایگزین Csn1 و Csx12) نام‌گذاری شد. همچنین موتیف HNH (His‑Asn‑His) که در نوکلئازهای دیگر نیز یافت می‌شود، شناسایی شد. بولوتین الگوی خاصی در توالی‌های نوکلئوتیدی در یک طرف اسپیسِرهای آرایه‌های CRISPR کشف کرد؛ نقش این پدیده بعدها در مطالعات بعدی روشن شد. امروزه موتیف‌های کوتاهی که در کنار پروتوسپیسِرها وجود دارند اما در اسپیسِرهای اصلی لوکوس CRISPR نیستند، به‌نام PAM (motifهای مجاور پروتوسپیسِر) شناخته می‌شوند. پروتوسپیسِرها قطعات DNA هستند که توسط سیستم ایمنی پروکاریوتیک هدف می‌شوند و با اسپیسِرهای مربوطه در لوکوس CRISPR یکسان‌اند، به‌جز وجود MOTIF PAM. این موتیف‌ها در مرحله شناسایی اطلاعات ژنتیکی خطرناک اهمیت دارند؛ حضور آن‌ها در انتهای توالی نشان می‌دهد که قطعه DNA خارجی است و باید تخریب شود، در حالی که توالی‌های ذخیره‌شده در لوکوس CRISPR به‌عنوان اسپیسِر و فاقد PAM توسط سیستم ایمنی پروکاریوتیک هدف قرار نمی‌گیرند.

یک بازیکن کلیدی در سیستم CRISPR‑Cas9، مولکول کوتاه RNA است؛ محصول پردازش‌شدهٔ رونویسی از لوکوس CRISPR که پروتئین‌های سیستم ایمنی پروکاریوتیک را به مولکول‌های خارجی حاوی اطلاعات ژنتیکی هدایت می‌کند. گروهی به رهبری جان ون در اوست (دانشگاه واگنینگن، هلند) وجود این مولکول‌های RNA را توصیف کرد و آن‌ها را crRNA (RNA مرتبط با CRISPR) نامید. همچنین اشاره شد که نتیجه اولیه رونویسی از لوکوس CRISPR یک پیش‌کرRNA پیش‌ساز است که شامل چندین اسپیسِر و تکرار است و سپس به قطعات فردی تقسیم می‌شود. در کار گروهی به رهبری ویروینیوس سیکسنیس (دانشگاه ویلنیوس، لیتوانی) نشان داده شد که طول 20 باز پایهٔ crRNA «راهنما» که مکمل DNA هدف است، برای فعالیت نوکلئاز کمپلکس CRISPR‑Cas کافی و ضروری است، حتی اگر اسپیسِر در لوکوس CRISPR توالی طولانی‌تری داشته باشد. این مقاله یکی از دو مطالعهٔ in vitro بود که به‌طور مستقل در آزمایشگاه‌های رقیب، برای اولین بار نشان دادند چگونه آنزیم Cas9 از crRNA برای حمله به DNA خارجی استفاده می‌کند.

قطعهٔ نهایی پازل که بدون آن نمی‌توانست سیستم CRISPR‑Cas9 را به‌صورت کارآمد در vitro بازسازی کرد، مولکول کوتاه RNA دیگری بود که در سال 2011 توسط گروه امانوئل شارپنتیه کشف شد؛ این مولکول که برای فعالیت نوکلئاز ضروری است، tracrRNA (RNA فعال‌کنندهٔ ترانس‑CRISPR) نام گرفت. در کارهای بعدی که نهایتاً منجر به دریافت جایزه نوبل شد، نقش tracrRNA در مکانیزم برش DNA هدف نشان داده شد. همچنین پیشنهاد شد که دو مولکول RNA، crRNA و tracrRNA، می‌توانند به‌صورت یک مولکول شیمیایی ترکیب شوند (sgRNA – RNA راهنمای تک‌تکه) که استفاده عملی از سیستم CRISPR‑Cas9 را در برنامه‌های بعدی بسیار ساده کرد.

**خط زمان تاریخی کشف اجزای سیستم CRISPR‑Cas9**
- 1987: تکرارهای کوتاه DNA که بعدها به‌نام CRISPR شناخته شدند، برای اولین بار در ژنوم‌های باکتری مشاهده شدند و در 1995 در آرکئا نیز یافت شدند.
- 2005: نقش لوکوس‌های CRISPR در محافظت از پروکاریوت‌ها در برابر اطلاعات ژنتیکی خارجی پیشنهاد شد و پروتئین Cas9 برای اولین بار توصیف شد (اطلاعات اولیه درباره پروتئین‌های مرتبط با لوکوس CRISPR در 2002 ظاهر شد).
- 2007 و 2011: دو مولکول RNA، crRNA و tracrRNA، به‌تدریج به‌عنوان بخش‌های ضروری برای تشکیل کمپلکس ریبونوکلئوتید‑پروتئین و شناسایی DNA زیرلایه کشف شدند.
- 2012: کار برندهٔ جایزه نوبل که تمام اجزا را در vitro ترکیب کرد و دو RNA را به‌صورت یک رشته ترکیبی برای سهولت استفاده از سیستم ترکیب کرد، منتشر شد.

**استفاده از سیستم CRISPR‑Cas9 در سلول‌های یوکاریوتی**
کشف اجزای کافی و ضروری سیستم CRISPR‑Cas9 مسابقه‌ای را برای اولین بار به‌کارگیری این سیستم در ویرایش ژنوم سلول‌های انسانی و حیوانی به راه انداخت. در ژانویهٔ 2013 تقریباً همزمان پنج مقالهٔ پژوهشی توسط تیم‌های مختلف منتشر شد که همه اعلام کردند به هدف رسیده‌اند. دو مقالهٔ منتشر شده در همان شمارهٔ *Science* توسط آزمایشگاه‌های جورج چرچ (دانشگاه هاروارد، ایالات متحده) و فنگ ژانگ (موسسه Broad، ایالات متحده) ارائه شد؛ در این مقالات نشان داده شد برای ویرایش موفق DNA در سلول‌های انسانی، چندین گام ضروری است: بهینه‌سازی کدون و افزودن سیگنال مکان‌یابی هسته‌ای به ژن cas9، طولانی‌سازی مولکول sgRNA برای بهبود کارایی، و احتمالاً افزودن قالب DNA برای همجوشی همولوگ که سلول‌ها می‌توانند شکستگی دوگانه DNA را تعمیر کنند (گام آخر فقط توسط گروه چرچ توصیف شد). در همان ژانویه 2013، مقالات مشابهی از آزمایشگاه‌های جنیفر دودنا (کالج برکلی، ایالات متحده)، جین‑سو کیم (دانشگاه سئول، کرهٔ جنوبی) و جِی. کیت جونگ (مدرسه پزشکی هاروارد، ایالات متحده) نیز منتشر شد. مقالهٔ جونگ بر روی ماهی‌ماهی (zebrafish) انجام شد اما برای اولین بار استفاده از CRISPR‑Cas9 در سلول‌های خط‌سیر (germline) نشان داد.

**اولین مطالعات کریستالوگرافی**
پروتئین Cas9 نوکلئاز بیشترین مطالعه را در میان پروتئین‌های Cas به خود اختصاص داده است؛ در حدود ۲۰ سال پس از کشف ژن‌های cas، بیش از ۲۰,۰۰۰ مقاله در PubMed به نام Cas9 اشاره کرده‌اند. تلاش برای به‌دست آوردن اطلاعات ساختاری دقیق این پروتئین منجر به انتشار دو مطالعهٔ کریستالوگرافی تقریباً همزمان شد: در فوریهٔ ۲۰۱۴ دو ساختار بلوری Cas9 در پایگاه داده PDBe ظاهر شد و مقالات همراه در مجلات *Nature* و *Cell* منتشر شدند. ساختاری که از آزمایشگاه جنیفر دودنا به‌دست آمد، یک پروتئین آپو (PDBe ID 4cmp) بود؛ در حالی که گروه اوساما نورکی (دانشگاه توکیو) موفق شد پروتئین را در ترکیب با RNA «راهنما» و DNA «هدف» بلورینه کند (PDBe ID 4oo8).

تمام این مطالعات و بسیاری دیگر از Cas9 *Streptococcus pyogenes* (SpCas9) استفاده کردند؛ این پروتئین ۱۳۶۸ آمینواسید دارد و یک نوکلئاز چنددامنه و چندکاره است. ساختارهای بلوری نشان دادند پروتئین Cas9 به‌صورت فضایی به دو لوب تقسیم می‌شود: لوب شناسایی هدف و لوب نوکلئاز؛ RNA راهنما و DNA هدف در شیار مثبت‌بار در نقطهٔ تلاقی این دو لوب قرار می‌گیرند. ساختارهای کلیدی لوب نوکلئاز SpCas9 شامل دو دامنه HNH و RuvC است که هر کدام یکی از رشته‌های DNA هدف را برش می‌دهند. شکل ۳ معماری کلی کمپلکس SpCas9‑sgRNA‑DNA را نشان می‌دهد که در آن ساختار ثانویهٔ RNA متصل و حالت باز شدهٔ DNA دو رشته‌ای با تشکیل هتردوپلیکسی DNA‑RNA قابل مشاهده است (PDB ID 5F9R). تا زمان نوشتن این مرور، صدها ساختار بلوری از پروتئین‌های خانواده Cas9 در پایگاه‌های PDB، PDBe و PDBj موجود است.

**اختلافات پتنتی**
انگیزهٔ قابل‌درک دانشمندان و سازمان‌های فعال در مطالعهٔ سیستم CRISPR‑Cas9، کسب منافع مالی احتمالی از این فناوری نویدبخش بود. یکی از اولین درخواست‌های پتنتی به‌صورت مشترک توسط دانشگاه کالیفرنیا برکلی (نماینده دودنا)، دانشگاه وین (جایی که یکی از دو نویسندهٔ اصلی مقاله کلیدی CRISPR‑Cas9 کار می‌کرد) و شارپنتیه به‌عنوان مخترع فردی (طبق قوانین دانشگاه اوما) در مه ۲۰۱۲ ثبت شد؛ در همان زمان، در دسامبر ۲۰۱۲، ژانگ و موسسه Broad نیز درخواست پتنتی ثبت کردند که همزمان با پذیرش مقالهٔ ژانگ در *Science* منتشر شد. ابتدا پتنت ژانگ موفق شد و در آوریل ۲۰۱۴ به ثبت رسید، در حالی که درخواست دودنا هنوز در دست بررسی بود. تیم دودنا با این تصمیم مخالف شد و منجر به یک منازعه طولانی بین دو طرف شد؛ شامل تجدیدنظرها و جلسات دادگاهی که در نهایت به وضعیت مبهمی در زمینهٔ مجوزهای CRISPR‑Cas9 منجر شد. تا سال ۲۰۱۹ هر دو طرف پتنتی در این حوزه داشتند؛ برخی شرکت‌های بیوتکنولوژی که از سیستم CRISPR‑Cas9 در سلول‌های انسانی استفاده می‌کردند، از تیم دودنا مجوز گرفتند، در حالی که دیگران از ژانگ. با این حال، هیئت تجدیدنظر دفتر پتنت و علامت تجاری ایالات متحده در فوریهٔ ۲۰۲۲ دوباره اولویت ژانگ و موسسه Broad را به‌عنوان دارندهٔ حق استفاده از CRISPR‑Cas9 در سلول‌های انسانی تأیید کرد؛ که این امر باعث ناامیدی و نارضایتی طرف مخالف و مشکلات مالی برای شرکت‌های دارای مجوز از تیم دودنا شد. دودنا و شارپنتیه در اروپا موفق به کسب پتنت‌های مشابه شدند و همچنین در بریتانیا، چین، ژاپن، استرالیا، نیوزیلند و مکزیک حق استفاده از فناوری را دارند.

**ژن‌درمانی و مسائل اخلاقی مرتبط**
سرعتی که آزمایشگاه‌های رقیب برای معرفی تحقیقات خود به عموم نشان دادند و مسابقهٔ پتنت‌گیری این فناوری، نشانگر اهمیت این پیشرفت علمی بود. بدون شک، یکی از نیروهای اصلی که بسیاری از دانشمندان را به مشارکت در پژوهش با این فناوری ترغیب کرد، پتانسیل تغییر سلول‌های انسانی، هم سوماتیک و هم جرثومی بود. با این حال، علیرغم مزایای واضح سیستم CRISPR‑Cas9، دشواری‌های اخلاقی و فنی متعددی بر سر راه پژوهشگرانی که آرزو دارند بیماری‌های تهدیدکننده حیات را درمان کنند، به‌ویژه اگر تغییرات ژنتیکی حاصل از این دستکاری‌ها قابل ارث باشد، وجود دارد.

در سپتامبر ۱۹۹۰ برای اولین بار ژن‌درمانی انجام شد: یک دختر چهار ساله مبتلا به نقص آنزیم ادنوزین دی‌آمیناز (ADA) یک تزریق از لنفوسیت‌های T مهندسی‌شده ژنتیکی دریافت کرد. سلول‌های گرفته‌شده از خون دختر با یک وکتور ویروسی (ویروس غیرفعال که نسخه سالم ژن را حمل می‌کرد) اصلاح شد. خبرنگارانی که این داستان را پوشش دادند نوشتند «به‌ندرت در پزشکی مدرن آزمایشی این‌چنین سرشار از امید بوده است» و دکتر وی. فرنچ اندرسون به‌عنوان «پدر ژن‌درمانی» شناخته شد. با گذشت زمان، شواهد نگران‌کننده‌ای از عوارض جانبی برخی تلاش‌های ژن‌درمانی در حیوانات و انسان‌ها جمع‌آوری شد. داستان تراژیک جسی گلسینگر، یک نوجوان آمریکایی از فیلادلفیا که در سال ۱۹۹۹ به‌دلیل اثرات ژن‌درمانی درگذشت، جهان را شوکه کرد و باعث شکاکیت گسترده و تأخیر قابل‌توجهی در توسعهٔ این فناوری شد. در مورد گلسینگر، واکنش ایمنی گستردهٔ بدن نسبت به وکتور ویروسی حامل ژن اورنیتین ترانس‌کاربامیل‌کیناز منجر به تب شدید، نارسایی کلیوی و ریوی، زردی، اختلال در انعقاد خون و در نهایت مرگ در عرض چهار روز پس از تزریق شد.

بحث‌های گسترده‌ای دربارهٔ ایمنی و به‌ویژه مسائل اخلاقی ناشی از امکان ژن‌درمانی بالقوه با CRISPR‑Cas9، بلافاصله پس از اولین مقالاتی که استفاده از این سیستم در سلول‌های انسانی را نشان می‌دادند، آغاز شد. یکی از اولین گام‌ها برای شروع این بحث‌ها، برگزاری کنفرانسی توسط دودنا در ژانویهٔ ۲۰۱۵ در دره ناپا، کالیفرنیا بود؛ این کنفرانس به مسایل علمی، پزشکی، قانونی و اخلاقی مرتبط با تغییرات ژنومی پرداخت. گزارش نتایج این کنفرانس در مارس ۲۰۱۵ در *Science* منتشر شد و به‌طور اساسی توصیه کرد که کار بر روی وارد کردن تغییرات ارثی در سلول‌های جنینی انسانی به‌طور قاطع متوقف شود، حداقل تا زمانی که پیامدهای اجتماعی، زیست‌محیطی و اخلاقی این دستکاری‌ها به‌طور کامل بررسی شود. تقریباً همزمان، مقاله‌ای در *Nature* دربارهٔ خطرات جدی ایجاد تغییرات ارثی در جنین‌های انسانی منتشر شد. نویسندگان ابراز نگرانی کردند که کار پیش‌دست بر روی سلول‌های جنینی می‌تواند تأثیر منفی بر حوزهٔ کلی ژن‌درمانی داشته باشد و پیشرفت پژوهشگران در درمان بیماری‌های ژنتیکی و عفونی در سلول‌های سوماتیک را سال‌ها به‌عقب براند.

در آوریل ۲۰۱۵، گروهی از دانشمندان دانشگاه سون یات‑سن (گوانگژو، چین) پس از عدم پذیرش دست‌نوشته‌های خود در *Nature* و *Science*، مقاله‌ای دربارهٔ استفاده از CRISPR‑Cas9 در سلول‌های جنینی انسانی منتشر کردند. آن‌ها تأکید کردند که از جنین‌های غیرقابل‌حیات استفاده کردند که از طریق ادغام دو سلول اسپرم با یک تخمک به‌دست آمده و در آزمایشگاه‌های IVF دور ریخته می‌شدند. نتیجه اصلی مقاله این بود که فناوری CRISPR‑Cas9 در زمان مطالعه هنوز برای استفاده در سلول‌های جنینی انسانی آماده نبود، زیرا کارایی و دقت کافی نداشت. یک نظر در مجله *Protein & Cell* (پکن) که این کار را منتشر کرد، بیان کرد که این مقاله (علاوه بر ارزش علمی‌اش) تبادل آزاد اطلاعات دربارهٔ پژوهش‌های جاری را ترویج می‌دهد؛ و علیرغم ابهام موضوع و نظرات متضاد، انتشار آن بحث‌های لازم دربارهٔ ویرایش ژنوم سلول‌های جرثومی را تحریک می‌کند.

اسکاندال‌های بدنام ناشی از انجام آزمایشات پزشکی بر روی انسان در گذشته، منجر به تدوین دستورالعمل‌های بین‌المللی کلی دربارهٔ بیواخلاقه شد. شناخته‌ترین اسناد در این زمینه، کد نورنبرگ (پس از محاکمه پزشکان نازی در ۱۹۴۷) و سپس بیانیه هلسینکی (۱۹۶۴) است که اصول کد را گسترش داد و کاربرد آن‌ها را در پژوهش‌های بالینی تشریح کرد. سند مهم دیگر، گزارش بلمنت (۱۹۷۸) است که توسط کمیسیون ملی حفاظت از افراد انسانی در پژوهش‌های زیست‌پزشکی و رفتاری ایالات متحده صادر شد؛ این کمیسیون پس از افشای آزمایش‌های غیرانسانی سیفیلیس در توسکیگی (۱۹۳۲‑۱۹۷۲) شکل گرفت.

کد نورنبرگ، بیانیه هلسینکی و گزارش بلمنت بر اصول اساسی اخلاق پژوهش‌های زیست‌پزشکی استوارند: احترام به فرد، رضایت آگاهانه بیمار، درک ریسک‌ها و مزایا، مشارکت داوطلبانه، عدالت در انجام آزمایش‌ها، حداکثر حرفه‌ای‌گری پژوهشگران و غیره. این اصول، و کاربرد آن‌ها در عمل پزشکی، به رویدادهای نوامبر ۲۰۱۸ مرتبط است؛ زمانی که دانشمند چینی جیانکوی هِی اعلام کرد نوزادانی به‌دنیا آمده‌اند که برای اولین بار تحت ویرایش ژنی با سیستم CRISPR‑Cas9 قرار گرفته‌اند. تزریق این سیستم به تخمک مادر در مرحلهٔ IVF، بلافاصله پس از ادغام اسپرم، انجام شد؛ بنابراین تمام تغییرات احتمالی وارد شده به ژنوم در این مرحله ارثی می‌شد. جامعه علمی جهانی از پیش‌دست بودن چنین آزمایش‌های پزشکی و خطرات بالای آن شاکی شد. به‌ویژه، دانشمندان نگران ایجاد جهش‌های ناخواسته («off‑target») در ژنوم نوزادان آینده بودند. هِی (که به‌عنوان JK شناخته می‌شد) پیش از این در جامعه CRISPR‑Cas9 شناخته‌شده نبود؛ اما پس از اعلام آزمایش‌هایش، توجه جهانی را به خود جلب کرد. او فیزیک را در دانشگاه علم و فناوری (هفئی، چین) تحصیل کرد، سپس به ایالات متحده رفت و دکترای خود را تحت نظارت مایکل دییم (پروفسور فیزیک، نجوم و مهندسی زیستی در دانشگاه ریس، هیوستون) دریافت کرد و سپس به‌عنوان پسادکترا در آزمایشگاه استیون کویک (استنفورد) کار کرد. در گروه دییم، او از روش‌های بیوفیزیک نظری، مدل‌سازی ریاضی و شبیه‌سازی‌های کامپیوتری استفاده می‌کرد و مقالاتی دربارهٔ انواع ویروس‌های آنفولانزا و توالی‌های اسپیسِر در لوکوس‌های CRISPR منتشر کرد؛ در آزمایشگاه کویک، روش‌های زیست‌مولکولی را آموخت و به فناوری‌های نوآورانه سیلیکون‌ولی علاقه‌مند شد. پس از بازگشت به چین، همکاری خود را با دییم ادامه داد و ایده‌های نوآورانه‌اش را در زمینهٔ توالی‌یابی DNA به‌کار گرفت و شرکت Direct Genomics را بر پایه این فناوری تأسیس کرد. در چین، او به‌عنوان دانشمند جوان و کارآفرین موفق تحت برنامهٔ هزار استعداد شناخته شد؛ در دانشگاه علم و فناوری جنوب (SUSTech، شنژن) موقعیت و آزمایشگاهی دریافت کرد و در ایجاد چندین استارت‑آپ مشارکت داشت. گام بعدی در کارنامه او، بزرگ‌ترین رسوایی پزشکی دههٔ اخیر بود. در سال ۲۰۱۷، در پلتفرم رسانه‌ای WeChat اعلام کرد که داوطلبانی از زوج‌های متاهل که می‌خواهند کودکانی با مقاومت ژنتیکی در برابر ویروس نقص ایمنی انسانی (HIV) داشته باشند، جذب می‌کند. یکی از شرایط این جذب این بود که هر دو نفر دارای مدرک دانشگاهی باشند تا بتوانند اصول علمی و پزشکی را درک کنند؛ شرط دیگر این بود که مرد HIV‑مثبت و زن HIV‑منفی باشد؛ وضعیتی که خطر انتقال ویروس به نوزاد را به‌حداقل می‌رساند (به‌شرطی که اسپرم در فرآیند IVF «شسته» شود) اما انگیزهٔ زوج‌ها برای شرکت در آزمایش را بالا می‌برد. هدف او ویرایش ژن CCR5 بود؛ یک گیرندهٔ شناخته‌شده روی سطح سلول که ویروس HIV به‌وسیلهٔ آن وارد سلول می‌شود. حدود ۳۰۰ نفر به این آگهی پاسخ دادند؛ از این میان ۲۰ زوج برای مشاورهٔ بعدی انتخاب شدند؛ پس از مشاوره ۱۱ زوج موافقت کردند؛ از این‌ها هفت نفر برای مرحلهٔ بعدی (IVF با ویرایش ژنوم) انتخاب شدند. انگیزهٔ افراد نه تنها داشتن فرزند (در چین IVF برای زوج‌های HIV‑مثبت ممنوع است) بلکه مشارکت در یک آزمایش «تاریخی» برای نفع نسل‌های آینده بود. پس از چندین تلاش ناموفق، از گروه منتخب دو بارداری به تولد نوزادانی منجر شد که تحت ویرایش ژنوم با CRISPR‑Cas9 قرار گرفته بودند. جزئیات بارداری اول (دو دختر دوقلو، لولو و نانا) به‌خوبی مستند است؛ اطلاعات کمی دربارهٔ بارداری دوم (یک کودک دیگر) موجود است؛ بسیاری از جزئیات این بارداری به‌دلیل رسوایی اول مخفی مانده‌اند. یک دست‌نوشتهٔ هِی که نتایج بارداری اول را توصیف می‌کند، «تولد دوقلوها پس از ویرایش ژنوم برای مقاومت در برابر HIV» نام دارد؛ این دست‌نوشته منتشر نشده اما به‌صورت نشت به جامعه علمی رسیده است. به‌عنوان مثال، در یکی از جنین‌ها هر دو نسخهٔ CCR5 غیرفعال شده‌اند (نانا)؛ در دیگری تنها یک نسخه تغییر یافته است (لولو). بنابراین فقط نانا احتمال محافظت در برابر HIV را دارد؛ لولو به‌دلیل داشتن یک نسخهٔ سالم CCR5، محافظت نخواهد داشت. تصور می‌شود دو جنین به رحم مادر منتقل شده‌اند به‌امید اینکه حداقل یکی به‌زودی تولد نوزاد ویرایش‌شده را به بار آورد. دوقلوها پیش‌دست (در ۳۱ هفته) متولد شدند و هفته‌های اولیهٔ زندگی خود را در انکوباتورهای نوزادان گذراندند؛ اما به‌طور کلی «سالم» توصیف شدند. پژوهشگرانی که به دست‌نوشتهٔ منتشر نشدهٔ هِی دسترسی داشتند، همچنین مشاهده کردند که برخی سلول‌های انتخاب‌شده برای توالی‌یابی در مراحل اولیهٔ توسعهٔ جنین، در واقع موزاییک بودند؛ این مشاهده باعث انتقادات بیشتری نسبت به کار هِی شد. در مورد موزاییک بودن، اطلاعات به‌دست‌آمده از توالی‌یابی سلول‌های منتخب نمی‌تواند به‌صورت کلی به کل جنین تعمیم یابد؛ بنابراین در زمان تصمیم‌گیری کلیدی برای انتقال جنین‌ها به رحم، پژوهشگران نمی‌توانستند مطمئن باشند که سیستم CRISPR‑Cas9 جهش‌های ناخواستهٔ دراماتیک در سلول‌های باقی‌ماندهٔ جنین ایجاد نکرده است، حتی اگر نتایج توالی‌یابی نشان‌دهندهٔ عدم وجود چنین تغییراتی در سلول‌های منتخب باشد. جنبه‌های دیگر این مطالعه نیز مورد انتقادات شدید جامعه علمی و پزشکی قرار گرفت؛ از جمله شرایط مشکوک دریافت مجوز از کمیته اخلاق یک بیمارستان در شنژن، سطح صلاحیت هِی برای پژوهش‌های بالینی (عدم تحصیلات پزشکی و تجربه کافی)، انتخاب ژن ویرایش‌شده (دلایل اجتماعی نه پزشکی)، عوارض احتمالی ناشی از عدم وجود نسخهٔ سالم CCR5 و غیره. به‌نظر کایران موسول‌نورو (پروفسور پزشکی دانشگاه پنسیلوانیا) این نوزادان «نسل CRISPR» نه به‌دلیل یک دستاورد علمی تاریخی، بلکه به‌دلیل یک فاجعهٔ اخلاقی تاریخی به‌وجود آمدند. یک کمپین روابط عمومی پیش از این توسط هِی و تیمش انجام شد که در روزنامهٔ People's Daily (بزرگ‌ترین روزنامه چین) پوشش خبری مثبت‌تری از کار او ارائه داد؛ اما رسوایی بین‌المللی منجر به حبس خانگی هِی و سپس حکم زندان سه ساله شد. او از زندان آزاد شده است، اما مکان و برنامه‌های آینده‌اش ناشناخته است.

چند ماه پس از این رسوایی، دانشمند روسی دنیس ربریکوو (پروفسور دانشگاه ملی پزشکی پیروگوف) با بیانیه‌ای دربارهٔ قصد خود برای تبدیل شدن به دومین دانشمند جهان که نوزادان ژنتیکی اصلاح‌شده تولید می‌کند، جامعه علمی بین‌المللی را به‌حیرت انداخت. ربریکوو، رئیس آزمایشگاه ویرایش ژنوم در مرکز زنان، زایمان و پریناتولوژی، اعلام کرد که مرکز تحقیقاتی او ممکن است در ژوئن ۲۰۱۹ آمادهٔ انتقال جنین‌های اصلاح‌شده به رحم مادر باشد. همانند آزمایش‌های هِی، او قصد ویرایش ژن CCR5 را داشت؛ اما کارهای اولیه‌اش بر روی جنین‌های غیرقابل‌حیات منتشر شد (در بولتن دانشگاه ملی پزشکی روسیه). واکنش جامعه علمی به این بیانیه گرم و عمدتاً منفی بود. در اکتبر ۲۰۱۹، مجلات *Nature* و *Science* خبرهایی منتشر کردند که نشان می‌داد ربریکوو به‌جای CCR5، به ویرایش ژن GJB2 (مرتبط با ناشنوایی ارثی) پرداخته و در حال انتخاب زوج‌هایی برای شرکت در آزمایش بود. با این حال، در مصاحبه‌های متعدد، ربریکوو تأکید کرد که تنها پس از دریافت تمام مجوزهای لازم از مراجع نظارتی و اخلاقی این آزمایش‌ها را انجام خواهد داد؛ این مسأله او را از هِی متمایز می‌کرد که پس از انجام آزمایش، نتایج را اعلام کرد. وزارت بهداشت فدراسیون روسیه (با توصیهٔ سازمان بهداشت جهانی) پس از این اعلام، بیان کرد که اعطای مجوز برای چنین مطالعه‌ای پیش‌دست و غیرمسئولانه است؛ که مانع پیشرفت بیشتر این موضوع تا زمانی که وضعیت نظارتی تغییر کند، شد.

در زمان نوشتن این مرور، چارچوب قانونی که مسئلهٔ ویرایش ژنوم سلول‌های جنینی انسانی را تنظیم می‌کند، در کشورهای مختلف به‌طور چشمگیری متفاوت است. به‌عنوان مثال، ویرایش ژنوم جنین‌ها برای مقاصد غیرتولیدی در حداقل ۱۱ کشور از جمله چین، ایالات متحده و بریتانیا مجاز است؛ نوزده کشور از جمله بلاروس، کانادا، سوئد و سوئیس این گونه آزمایش‌ها را ممنوع کرده‌اند؛ بسیاری از کشورها (از جمله روسیه) موضع میانه یا نامشخصی اتخاذ کرده‌اند. وضعیت اعمال تغییرات ژنتیکی ارثی در جنین‌های مورد استفاده برای اهداف تولید مثل حتی پیچیده‌تر است.

**کاربردهای پزشکی با سلول‌های سوماتیک انسانی**
با وجود توجه فزاینده به وارد کردن تغییرات ارثی در سلول‌های جرثومی، استفاده کمتر جنجالی و در حال حاضر رایج‌تر CRISPR‑Cas9 برای مقاصد پزشکی، ویرایش سلول‌های سوماتیک انسانی است. همان‌طور که در بالا اشاره شد، در اولین تلاش‌های ژن‌درمانی (۱۹۹۰) یک وکتور ویروسی وابسته به آدنو‑اسوسییتد (AAV) استفاده شد که نسخه سالم ژن را به سلول‌ها منتقل می‌کرد (در ایالات متحده این فناوری در نهایت در سال ۲۰۱۷ برای استفاده بالینی تأیید شد). گام بعدی در توسعهٔ ژن‌درمانی، معرفی ویرایش ژنوم با استفاده از آنزیم‌های Endonuclease (HEs)، نوکلئازهای Zinc Finger (ZFNs)، نوکلئازهای TALEN و سپس CRISPR‑Cas9 بود. اولین مطالعات بالینی انسانی با CRISPR‑Cas9 در اکتبر ۲۰۱۶ در چین آغاز شد؛ ژن PD‑1 به‌صورت ex vivo در سلول‌های خونی غیرفعال شد به‌امید اینکه این سلول‌های اصلاح‌شده به سرطان ریهٔ غیر‌کوچک‌سلولی بیمار حمله کنند. در ایالات متحده، اولین درمان ex vivo با CRISPR‑Cas9 در ژوئیه ۲۰۱۹ بر روی بیماری آنمی سلول داسی شکل (سیکل سل) انجام شد (CRISPR Therapeutics، تأسیس‌شده توسط شارپنتیه). این درمان وضعیت بیمار را برای حداقل چند ماه بهبود داد؛ اما هزینهٔ چنین درمانی در زمان اجرا در ایالات متحده بین ۰٫۵ تا ۱٫۵ میلیون دلار تخمین زده شد. هزینهٔ بالای فعلی درمان‌های CRISPR‑Cas9 احتمالاً مانعی برای استفادهٔ گسترده آن خواهد بود، حتی اگر آزمایشات بالینی کارایی و ایمنی را تأیید کنند. در حال حاضر، گران‌ترین داروی موجود در بازار Zolgensma است؛ یک ژن‌درمانی دیگر برای آتروفی عضلانی نخاعی که هزینهٔ هر دوز آن ۲٫۱۲۵ میلیون دلار است. Zolgensma مستقیم یک نسخهٔ سالم ژن را با استفاده از ویروس آدنو‑اسوسییتد به سلول‌ها می‌رساند؛ روشی متفاوت از ویرایش ژنوم با نوکلئازها.

اولین مثال از یک مطالعه بالینی in vivo که سلول‌ها به‌صورت مستقیم در محل خود ویرایش ژنوم می‌شوند، با فناوری ZFN در ژوئیه ۲۰۱۷ بر روی بیماری هانتر (یک بیماری ژنتیکی نادر) انجام شد. پیشگامان استفاده از CRISPR‑Cas9 برای ویرایش ژنوم in vivo، شرکت Editas Medicine (مارس ۲۰۲۰) بودند؛ دارویی به نام EDIT‑101 به‌صورت موضعی به شبکیهٔ بیمار مبتلا به یک نوع نابینایی ارثی ناشی از جهش در ژن CEP290 تزریق شد. در حال حاضر، مطالعات بالینی متعددی بر روی استفاده از CRISPR‑Cas9 برای درمان بیماری‌هایی مانند آلزایمر، انواع مختلف سرطان، کلسترول بالا، آنژیوئدم، لوسمی حاد میلوئید و حتی ریزش مو (آلوپسی آندروژنتیک) در حال انجام است. یک کاربرد امیدوارکننده دیگر برای CRISPR‑Cas9 در آینده، درمان بیماری‌های عفونی ناشی از پاتوژن‌هایی مانند HIV و ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) است.

**نتیجه‌گیری**
کشف CRISPR‑Cas9 به‌عنوان یک سیستم ایمنی در پروکاریوت‌ها در آستانهٔ قرن بیست و یکم – کشفی که در نگاه اول فقط برای میکروبیولوژی مرتبط به‌نظر می‌رسید – منجر به انقلاب در زمینهٔ دستکاری‌های ژنومی شد. فرصت‌های جدیدی در حوزه‌های مختلف بیومدیسین، مانند تشخیص مولکولی بیماری‌های عفونی و غیرعفونی (مثلاً ژنوتیپینگ باکتری‌ها، تشخیص ویروس‌ها و شناسایی جهش‌های ژنتیکی در DNA خارج‌سلولی در بیماران مبتلا به سرطان ریه) و همچنین توسعهٔ روش‌های جدید ایمنی‌زایی، واکسن‌های DNA، فراهم شد. یکی از نمونه‌های غیرمعمول کاربرد سیستم CRISPR‑Cas9، کشت ارگان‌های شبیه‌ساز مغز با انواع مختلف ژن NOVA1 که در انسان‌های مدرن، نئاندرتال‌ها و دنیسوان‌ها وجود دارد، بود. توسعهٔ فناوری CRISPR‑Cas9 نمونه‌ای خوب از این است که کشفیات حاصل از پژوهش‌های پایه می‌توانند کل حوزه‌های علم و فناوری را تغییر دهند و افق‌های ممکن را گسترش دهند. این تکنیک پیشگام، ادامه‌دار رویدادهای علمی هیجان‌انگیزی است که شامل انتشار ساختار دو‌رشته‌ای DNA توسط واتسون و کریک در ۱۹۵۳، تولد اولین کودک از طریق لقاح مصنوعی در ۱۹۷۸ و کلون‌سازی گوسفند دولی در ۱۹۹۶ می‌شود. در سال‌های آینده، جامعهٔ علمی با علاقه پیشرفت قوانین و اصول اخلاقی در کاربرد سیستم CRISPR‑Cas9 برای ویرایش ژنوم را دنبال خواهد کرد و همچنین به این سؤال که این فناوری نویدبخش در چه حوزه‌های دیگری از علم به کار خواهد رفت، می‌نگرد.

**تشکر و قدردانی**
نویسنده با گرمی و سپاس‌گزاری به سال‌هایی که در آزمایشگاه آندره دیمیتریویچ وینوگرافوف در بخش بیوشیمی دانشگاه دولتی مسکو سپری کرد، یاد می‌کند. آزمایش‌های طراحی‌شده توسط آندره دیمیتریویچ همواره نتایج جالبی به‌دست می‌دادند، در حالی که دانش وسیع او در زمینه‌های مختلف علم، به کارکنان و دانشجویان این امکان را می‌داد که مطمئن باشند هر سؤال‌ایی پاسخ خواهد یافت و زمان صرف‌شده در آزمایشگاه نتایج شایسته‌ای به‌دست خواهد آورد. انتشار نتایج کارهای انجام‌شده تحت نظارت آندره دیمیتریویچ، شروع لازم برای زندگی علمی نویسنده و فرصت ادامهٔ پژوهش در آزمایشگاه‌ها و حوزه‌های دانش دیگر را فراهم کرد. تیمی منحصربه‌فرد از دانشمندان که توسط آندره دیمیتریویچ انتخاب شده بودند: ورا گئورگیونا گریونیکوا، تاتیانا وادیمونا ژاروا و الیونورا ولادیمیرونا گاوریکوا، فضایی خانوادگی از اعتماد و حمایت در آزمایشگاه فراهم کردند که نویسنده به‌خاطر آن بسیار سپاسگزار است.

**اختصارات**
cas – ژن‌های مرتبط با CRISPR
CRISPR – تکرارهای کوتاه پالیندرمیک به‌صورت منظم و فواصل‌دار
crRNA – RNA مرتبط با CRISPR
PAM – موتیف‌های مجاور پروتوسپیسِر
sgRNA – RNA راهنمای تک‌تکه
SpCas9 – پروتئین Cas9 از *Streptococcus pyogenes*
tracrRNA – RNA فعال‌کنندهٔ ترانس‑CRISPR

**بیانیه اخلاقی**
نویسنده هیچ تضاد منافع مالی اعلام نمی‌کند. این مقاله شامل توصیف مطالعاتی که نویسنده با مشارکت افراد یا حیوانات به‌عنوان موضوع انجام داده است، نمی‌باشد.


فهرست مجلات
BMJ Open Access
PMC4975809

آگوست 2016؛ 101(4): 213–215.
مقدمه
تکرارهای پالیندرومیک متوالی و خوشه‌ای (CRISPR)/Cas9 یک فناوری ویرایش ژن است که تحولی بزرگ در تحقیقات زیست‌پزشکی ایجاد کرده است. این فناوری امکان اصلاح خطاها در ژنوم و روشن یا خاموش کردن ژن‌ها در سلول‌ها و ارگانیسم‌ها را به سرعت، با هزینه کم و با سهولت نسبی فراهم می‌کند. این فناوری کاربردهای آزمایشگاهی متعددی دارد از جمله تولید سریع مدل‌های سلولی و حیوانی، غربالگری‌های ژنومی عملکردی و تصویربرداری زنده از ژنوم سلولی.1 نشان داده شده است که می‌توان از آن برای ترمیم DNA معیوب در موش‌ها و درمان اختلالات ژنتیکی آن‌ها استفاده کرد2 و گزارش شده است که می‌توان جنین‌های انسان را به طور مشابه اصلاح کرد.3 سایر کاربردهای بالینی بالقوه شامل ژن‌درمانی، درمان بیماری‌های عفونی مانند HIV و مهندسی مواد خودی بیمار برای درمان سرطان و سایر بیماری‌ها است. در این بررسی، مروری بر CRISPR/Cas9 ارائه خواهیم داد و بر تأثیر احتمالی آن بر تخصص اطفال تأکید خواهیم کرد. اگرچه احتمالاً تأثیر قابل توجهی بر اطفال از طریق تأثیر آن در آزمایشگاه خواهد داشت، در اینجا بر کاربردهای بالینی بالقوه آن تمرکز خواهیم کرد. همچنین به برخی از دشواری‌ها و بحث‌های اخلاقی مرتبط با این فناوری نوین خواهیم پرداخت.
مروری بر CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9 یک فناوری ویرایش ژن است که شامل دو جزء ضروری است: یک RNA راهنما برای مطابقت با ژن هدف مورد نظر و Cas9 (پروتئین مرتبط با CRISPR 9) - یک اندونوکلئاز که باعث شکستگی دو رشته‌ای DNA می‌شود و امکان اصلاحات ژنوم را فراهم می‌کند (به شکل 1 مراجعه کنید).

سیستم CRISPR/Cas9.1 تکرارهای پالیندرومیک متوالی و خوشه‌ای (CRISPR) به توالی‌هایی در ژنوم باکتریایی اشاره دارد. آن‌ها در ترکیب با مجموعه‌ای از پروتئین‌های مرتبط با CRISPR (Cas) در برابر ویروس‌های مهاجم محافظت می‌کنند. Cas9، یکی از پروتئین‌های مرتبط، یک اندونوکلئاز است که هر دو رشته DNA را برش می‌دهد. Cas9 توسط بخشی از RNA به هدف خود هدایت می‌شود. این می‌تواند به صورت یک رشته واحد به نام RNA راهنمای مصنوعی (sgRNA) سنتز شود. بخشی از RNA که به DNA ژنومی متصل می‌شود، 18-20 نوکلئوتید است. برای برش، یک توالی خاص DNA بین 2 تا 5 نوکلئوتید (توالی دقیق به باکتری که Cas9 را تولید می‌کند بستگی دارد) باید در انتهای 3' RNA راهنما قرار داشته باشد: این به عنوان موتیف مجاور پروتواسپیسر (PAM) نامیده می‌شود. ترمیم پس از برش DNA ممکن است از طریق دو مسیر رخ دهد: اتصال انتهای غیرهمولوگ، که معمولاً منجر به درج/حذف تصادفی DNA می‌شود، یا ترمیم هدایت‌شده همولوگ که در آن یک قطعه DNA همولوگ به عنوان الگوی ترمیم استفاده می‌شود. مورد دوم امکان ویرایش دقیق ژنوم را فراهم می‌کند: بخش همولوگ DNA با تغییر توالی مورد نظر ممکن است همراه با نوکلئاز Cas9 و sgRNA تحویل داده شود و از نظر تئوری امکان ایجاد تغییراتی به دقت یک جفت باز را فراهم کند.
کاربردهای بالینی بالقوه
اصلاح اختلالات ژنتیکی
یکی از هیجان‌انگیزترین کاربردهای CRISPR/Cas9، پتانسیل آن برای درمان اختلالات ژنتیکی ناشی از جهش‌های تک ژنی است. نمونه‌هایی از این بیماری‌ها شامل فیبروز کیستیک (CF)، دیستروفی عضلانی دوشن (DMD) و هموگلوبینوپاتی‌ها است. تاکنون، این رویکرد فقط در مدل‌های پیش‌بالینی تأیید شده است، اما امید است که به زودی به عمل بالینی ترجمه شود.

Schwank et al. از CRISPR/Cas9 برای بررسی درمان CF استفاده کردند. با استفاده از سلول‌های بنیادی روده بزرگ از دو بیمار مبتلا به CF، آن‌ها با موفقیت رایج‌ترین جهش ایجاد کننده CF را در ارگانوئیدهای روده اصلاح کردند. آن‌ها نشان دادند که پس از اصلاح جهش، عملکرد گیرنده رسانای غشایی CFTR بازیابی شد.4

بیماری دیگری که CRISPR/Cas9 در آن مورد بررسی قرار گرفته است، DMD است. Tabebordbar et al. اخیراً از تحویل ویروس مرتبط آدنو (AAV) نوکلئازهای CRISPR/Cas9 برای بازیابی بیان دیستروفین در یک مدل موشی DMD با حذف اگزون حاوی جهش اصلی استفاده کردند. این امر پروتئینی کوتاه شده اما همچنان عملکردی تولید می‌کند. نشان داده شد که موش‌های درمان شده تا حدی کمبود عملکرد عضلانی را بهبود می‌بخشند.5 به طور قابل توجهی، نشان داده شد که ژن دیستروفین در سلول‌های بنیادی عضلانی که بافت عضلانی بالغ را تجدید می‌کنند، ویرایش شده است. این امر برای اطمینان از اینکه اثرات درمانی CRISPR/Cas9 در طول زمان از بین نمی‌روند، مهم است. دو مطالعه مشابه دیگر استفاده از سیستم CRISPR/Cas9 در شرایط زنده را برای افزایش بیان ژن دیستروفین و بهبود عملکرد عضلانی در مدل‌های موشی DMD توصیف کرده‌اند.6 7 مطالعات دیگر از CRISPR/Cas9 برای هدف قرار دادن تکرار اگزون‌ها در ژن دیستروفین انسان در شرایط آزمایشگاهی استفاده کرده‌اند و نشان داده‌اند که این رویکرد می‌تواند منجر به تولید دیستروفین با طول کامل در میوتوبول‌های فرد مبتلا به DMD شود.8

CRISPR/Cas9 همچنین می‌تواند برای درمان هموگلوبینوپاتی‌ها استفاده شود. Canver et al.9 اخیراً نشان دادند که اختلال تقویت‌کننده BCL11A توسط CRISPR/Cas9 می‌تواند هموگلوبین جنینی را در موش‌ها و سلول‌های اریتروبلاست انسانی اولیه القا کند. در آینده، چنین رویکردی می‌تواند امکان بیان هموگلوبین جنینی را در بیماران مبتلا به هموگلوبین بزرگسال غیرطبیعی فراهم کند. این یک استراتژی درمانی جدید در بیماران مبتلا به بیماری‌هایی مانند کم‌خونی داسی‌شکل یا تالاسمی خواهد بود. وارد کردن یک ژن β-گلوبین کاملاً عملکردی بسیار چالش‌برانگیزتر است، به همین دلیل این رویکرد تا حدودی غیرمعمول است.
درمان HIV
یکی دیگر از کاربردهای بالینی بالقوه CRISPR/Cas9، درمان بیماری‌های عفونی مانند HIV است. اگرچه درمان ضد رتروویروسی یک درمان موثر برای HIV است، اما در حال حاضر هیچ درمانی وجود ندارد زیرا ویروس به طور دائم در ژنوم میزبان ادغام می‌شود. Hu et al. نشان دادند که سیستم CRISPR/Cas9 می‌تواند برای هدف قرار دادن فعالیت ژنوم HIV-1 استفاده شود. این امر بیان و تکثیر ژن HIV را در انواع سلول‌هایی که می‌توانند به طور نهفته به HIV آلود شوند، بدون هیچ گونه اثرات سمی غیرفعال کرد. علاوه بر این، سلول‌ها می‌توانند در برابر عفونت HIV-1 ایمن شوند. این یک پیشرفت درمانی بالقوه در غلبه بر مشکل فعلی چگونگی حذف HIV از افراد آلوده است. پس از اصلاح بیشتر، نویسندگان پیشنهاد می‌کنند که یافته‌های آن‌ها ممکن است امکان ژن‌درمانی یا پیوند سلول‌های بنیادی مغز استخوان یا سلول‌های بنیادی چندپتانسیل القایی که از نظر ژنتیکی تغییر یافته‌اند را برای ریشه‌کن کردن عفونت HIV فراهم کند.10

مهندسی سلول‌های سوماتیک به صورت برون‌تنی برای درمان بدخیمی یا سایر بیماری‌ها
علاقه فزاینده‌ای به امکان استفاده از CRISPR/Cas9 برای اصلاح سلول‌های T مشتق شده از بیمار و سلول‌ها/سلول‌های پیش‌ساز که سپس می‌توانند برای درمان بیماری به بیماران بازگردانده شوند، وجود دارد. این رویکرد ممکن است برخی از مشکلات مرتبط با نحوه تحویل کارآمد ویرایش ژن به سلول‌های مناسب را برطرف کند.

مهندسی ژنوم سلول‌های T قبلاً در درمان بدخیمی‌های خونی موفقیت‌آمیز بوده است و پتانسیل درمان سرطان‌های جامد، نقص ایمنی اولیه و بیماری‌های خودایمنی را دارد. دستکاری ژنتیکی سلول‌های T قبلاً ناکارآمد بوده است. با این حال، Schumann et al. اخیراً یک رویکرد موثرتر را در سلول‌های T CD4+ انسانی بر اساس سیستم CRISPR/Cas9 گزارش کردند. تکنیک آن‌ها امکان حذف و وارد کردن ژنومی تجربی و درمانی را در سلول‌های T انسانی اولیه فراهم کرد. آن‌ها نشان دادند که می‌توان سلول‌های T را دستکاری کرد تا از بیان پروتئین PD-1 جلوگیری شود، که کارهای دیگر نشان داده‌اند ممکن است به سلول‌های T اجازه دهد تا سرطان‌های جامد را هدف قرار دهند.11

علاقه دیگری نیز به استفاده از ویرایش ژنوم با واسطه CRISPR/Cas9 در سلول‌های بنیادی چندپتانسیل یا سلول‌های بنیادی سوماتیک اولیه برای درمان بیماری وجود دارد. به عنوان مثال، Xie et al.12 نشان دادند که جهش ایجاد کننده β-تالاسمی را می‌توان در سلول‌های بنیادی القایی پلوریپوتنت انسانی به صورت برون‌تنی اصلاح کرد. آن‌ها پیشنهاد می‌کنند که در آینده، چنین رویکردی می‌تواند منبعی از سلول‌ها را برای پیوند مغز استخوان برای درمان β-تالاسمی و سایر بیماری‌های ژنتیکی مشابه فراهم کند.
محدودیت‌ها
چالش‌های متعددی باقی مانده است تا پتانسیل CRISPR/Cas9 بتواند به درمان‌های موثر در کنار تخت تبدیل شود. یکی از مسائل خاص، نحوه تحویل ویرایش ژن به سلول‌های مناسب، به ویژه اگر درمان قرار باشد به صورت زنده تحویل داده شود، است. برای تحویل ایمن ژن‌های رمزگذاری کننده Cas9-نوکلئاز و RNAهای راهنما در شرایط زنده بدون سمیت مرتبط، یک بردار مناسب مورد نیاز است. AAV قبلاً یک گزینه ترجیحی برای تحویل ژن بوده است.1 با این حال، این سیستم تحویل ممکن است برای انتقال کارآمد ژن Cas9 خیلی کوچک باشد.1 یک ژن Cas9 کوچکتر می‌تواند استفاده شود، اما این پیامدهای اضافی بر اثربخشی دارد.1 سیستم‌های تحویل غیر ویروسی متعددی در حال بررسی هستند و این فرآیند نیاز به بهینه‌سازی بیشتر دارد.

نگرانی قابل توجه دیگر، احتمال اثرات خارج از هدف بر روی قسمت‌هایی از ژنوم جدا از ناحیه مورد هدف است. ویرایش‌های ناخواسته ژنوم می‌تواند عوارض طولانی مدت جدی برای بیماران، از جمله بدخیمی ایجاد کند. غلظت آنزیم نوکلئاز Cas9 و مدت زمانی که Cas9 بیان می‌شود، هر دو هنگام محدود کردن فعالیت خارج از هدف مهم هستند.1 اگرچه اصلاحات اخیر در نوکلئاز ویژگی را افزایش داده است، اما کار بیشتری برای به حداقل رساندن اثرات خارج از هدف و ایجاد ایمنی طولانی مدت هر درمانی مورد نیاز است.

کاربردهای درمانی CRISPR/Cas9 مورد بررسی در این مقاله عمدتاً بر روی سلول‌های سوماتیک متمرکز شده است. یک مسئله بحث‌برانگیز به ویژه در مورد CRISPR/Cas9، ویرایش ژن در جنین‌ها است. نشان داده شده است که فناوری CRISPR/Cas9 می‌تواند ژنوم جنین‌های انسان را تغییر دهد3 که از نظر تئوری می‌تواند در درمان پیش از پیوند بیماری‌های ژنتیکی مفید باشد. با این حال، هر گونه اصلاح ژنتیکی خط ژرمی دائمی است و پیامدهای طولانی مدت آن نامشخص است. بسیاری با هرگونه اصلاح خط ژرمی مخالفت می‌کنند و استدلال می‌کنند که یک پیامد نهایی می‌تواند افزایش ژنتیکی غیردرمانی باشد.13 واضح است که مرزهای اخلاقی که در آن می‌توان از CRISPR/Cas9 استفاده کرد، هنوز باید به طور کامل تعیین شود.
نتیجه‌گیری بالینی

فناوری CRISPR/Cas9 پتانسیل متحول کردن درمان بسیاری از بیماری‌های کودکان را دارد.
چالش‌های عملی و اخلاقی متعددی باید قبل از اینکه این پتانسیل بتواند در کنار تخت به واقعیت تبدیل شود، برطرف شود.

یادداشت‌ها
مشارکت‌کنندگان: DK ایده این مقاله را مطرح کرد. همه نویسندگان در نوشتن و بررسی نسخه نهایی دست داشتند.
تأمین مالی: AK از بورس تحصیلی Wellcome Trust (108785/Z/15/Z) حمایت می‌شود.
تضاد منافع: اعلام نشده است.
منبع و بررسی همتایان: غیر کمیسیونی؛ بررسی همتایان خارجی.
منابع
1. Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering. Cell 2014;157:1262–78. 10.1016/j.cell.2014.05.010 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
2. Yin H, Xue W, Chen S, et al.. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotech 2014;32:551–3. 10.1038/nbt.2884 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
3. Liang P, Xu Y, Zhang X, et al.. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 2015;6:363–72. 10.1007/s13238-015-0153-5 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
4. Schwank G, Koo BK, Sasselli V, et al.. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell 2013;13:653–8. 10.1016/j.stem.2013.11.002 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
5. Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JK, et al.. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science 2016;351:407–11. 10.1126/science.aad5177 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
6. Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, et al.. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science 2016;351:403–7. 10.1126/science.aad5143 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
7. Long C, McAnally JR, Shelton JM, et al.. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9–mediated editing of germline DNA. Science 2014;345:1184–8. 10.1126/science.1254445 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
8. Wojtal D, Kemaladewi Dwi U, Malam Z, et al.. Spell checking nature: versatility of CRISPR/Cas9 for developing treatments for inherited disorders. Am J Hum Genet 2016;98:90–101. 10.1016/j.ajhg.2015.11.012 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
9. Canver MC, Smith EC, Sher F, et al.. BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 2015;527:192–7. 10.1038/nature15521 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
10. Hu W, Kaminski R, Yang F, et al.. RNA-directed gene editing specifically eradicates latent and prevents new HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci USA 2014;111:11461–6. 10.1073/pnas.1405186111 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
11. Schumann K, Lin S, Boyer E, et al.. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:10437–42. 10.1073/pnas.1512503112 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
12. Xie F, Ye L, Chang JC, et al.. Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac. Genome Res 2014;24:1526–33. 10.1101/gr.173427.114 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
13. Lanphier E, Urnov F, Haecker SE, et al.. Don't edit the human germ line. Nature 2015;519:410–1. 10.1038/519410a [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

مقالات از Archives of Disease in Childhood. Education and Practice Edition با مجوز از BMJ Publishing Group ارائه شده‌اند.